人體p16基因甲基化檢測試劑盒產(chǎn)品說明書(中文版)

主要用途

YIJI人體p16基因甲基化檢測試劑是一種旨在通過化學(xué)方法使基因組中的所有胞嘧啶（CYTOSINE）轉(zhuǎn)變成尿嘧啶（URACIL），而保留了所有甲基化的胞嘧啶，經(jīng)過甲基化特異性PCR擴(kuò)增，探測到人體腫瘤抑制基因p16啟動子  島甲基化信息的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗證明的。可以被用于人體腫瘤抑制基因p16相關(guān)的腫瘤表觀遺傳學(xué)研究。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作簡便，轉(zhuǎn)化保證。

技術(shù)背景

在基因的啟動子區(qū)域（promotor region）通常存在一些富含重復(fù)雙核苷酸“”的區(qū)域，稱為“島”（ island）。在人類基因組內(nèi)，存在有近3萬個島。這些島不僅是基因的一種標(biāo)志，而且還參與基因表達(dá)的調(diào)控和影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，更是DNA甲基化的唯一位置。島甲基化形態(tài)的掃描分析是基因表達(dá)和表觀基因組學(xué)的主要課題。p16基因，又稱為細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑2A（Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A）或  ，是人體腫瘤抑制基因之一。其功能在于抑制CDK4激酶的活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。由于RNA剪切，p16具有三種轉(zhuǎn)錄體：  。一旦突變或甲基化，會造成細(xì)胞繁殖調(diào)控機(jī)制缺失，而致腫瘤或細(xì)胞衰老等。

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI緩沖液（Reagent A）      毫升YIJI變性液（Reagent B） 微升YIJI處理液（Reagent C） 毫升YIJI轉(zhuǎn)化液（Reagent D） 毫升YIJI封隔液（Reagent E） 毫升YIJI凈化液（Reagent F） 毫升YIJI萃取液（Reagent G）   毫升YIJI濃縮液（Reagent H） 毫升YIJI助沉液（Reagent I） 微升YIJI沉淀液（Reagent J） 毫升YIJI清理液（Reagent K）   毫升YIJI保存液（Reagent L） 毫升YIJI擴(kuò)增液（Reagent M） 微升YIJI補(bǔ)充液（Reagent N） 毫升YIJI U引物F（Reagent O） 微升YIJI U引物R（Reagent P） 微升YIJI M引物F（Reagent Q） 微升YIJI M引物R（Reagent R） 微升YIJI針筒離心柱 套

產(chǎn)品說明書 1份

保存方式

保存GENMED處理液（Reagent C）、GENMED轉(zhuǎn)化液（Reagent D）、GENMED助沉液（Reagent I）、GENMED擴(kuò)增液（Reagent M）、GENMED補(bǔ)充液（Reagent N）、GENMED U引物F（Reagent O）、GENMED U引物R（Reagent P）、GENMED M引物F（Reagent Q）和GENMED M引物R（Reagent R）在－20℃冰箱里；GENMED凈化液（Reagent F）和GENMED針筒離心柱保存在室溫下；其余的保存在4℃冰箱里；GENMED處理液（Reagent C）和GENMED轉(zhuǎn)化液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

2.0毫升離心管：用于樣品操作的容器

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)物

微型臺式離心機(jī)：用于沉淀樣品或去除雜質(zhì)

渦旋震蕩儀：用于混勻反應(yīng)物

真空泵：用于去除樣品中的液體成分

針筒擠壓塞：用于去除樣品中的液體成分

PCR儀：用于樣品擴(kuò)增

PCR管或平板：用于PCR反應(yīng)的容器

測序試劑盒：用于測序前的產(chǎn)物處理

實(shí)驗步驟

實(shí)驗開始前，將GENMED處理液（Reagent C）和GENMED轉(zhuǎn)化液（Reagent D）從－20℃冰箱中取出，置入室溫下。同時將其中一管GENMED緩沖液（Reagent A）置入65℃恒溫水槽中預(yù)熱備用。然后進(jìn)行下列操作：

• 轉(zhuǎn)化實(shí)驗

• 準(zhǔn)備1個2.0毫升離心管
• 加入2微克DNA樣品
• 加入適量的GENMED緩沖液（Reagent A）到50微升反應(yīng)體系（注意：不要使用65℃預(yù)熱的GENMED緩沖液（Reagent A））
• 加入xx微升GENMED變性液（Reagent B），混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育12分鐘
• 加入xx微升GENMED處理液（Reagent C）（注意：可見溶液呈現(xiàn)黃色）
• 在渦旋震蕩儀上小心震蕩30秒，充分混勻
• 加入xx微升GENMED轉(zhuǎn)化液（Reagent D），上下傾倒混勻
• 加入xx微升GENMED封隔液（Reagent E）
• 放進(jìn)55℃恒溫水槽孵育16小時
• 小心抽去xx微升GENMED封隔液（Reagent E）
• 加入xx毫升充分搖勻的GENMED凈化液（Reagent F），上下傾倒混勻
• 移入到針筒離心柱
• 連接到真空泵，將柱內(nèi)液體抽去（或使用用戶自備的針筒擠壓塞擠去柱內(nèi)液體）
• 加入xx毫升GENMED萃取液（Reagent G）
• 運(yùn)用真空泵，將GENMED萃取液（Reagent G）抽去（或使用用戶自備的針筒擠壓塞擠去柱內(nèi)液體）
• 重復(fù)實(shí)驗步驟15至16一次
• 去掉針筒，將離心柱放在1.5毫升離心管
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心20秒，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 加入xx微升65℃預(yù)熱的GENMED緩沖液（Reagent A）到離心柱
• 室溫下靜置1分鐘
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心20秒，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 去掉離心柱
• 加入xx微升GENMED變性液（Reagent B）到離心管，混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育12分鐘
• 加入xx微升GENMED濃縮液（Reagent H）
• 加入xx微升GENMED助沉液（Reagent I）
• 加入xx微升GENMED沉淀液（Reagent J）
• 在渦旋震蕩儀上強(qiáng)烈震蕩30秒
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入xx毫升GENMED清理液（Reagent K）
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入xx微升GENMED保存液（Reagent L）
• 放進(jìn)－20℃冰箱長期保存

二、甲基化特異性PCR

• 將GENMED擴(kuò)增液（Reagent M）、GENMED補(bǔ)充液（Reagent N）、GENMED U引物F（Reagent O）、GENMED U引物R（Reagent P）、GENMED M引物F（Reagent Q）和GENMED M引物R（Reagent R）從－20℃冰箱里取出
• 置入冰槽里直至融化
• 針對一個樣本，準(zhǔn)備2個PCR管，分別標(biāo)記為U和M管
• 分別移出xx微升GENMED擴(kuò)增液（Reagent M）到PCR管里
• 分別加入1微升上述轉(zhuǎn)化實(shí)驗中獲得的DNA樣品（總量100納克）
• 分別加入xx微升GENMED U引物F（Reagent O）和GENMED U引物R（Reagent P）到U管中
• 分別加入xx微升GENMED M引物F（Reagent Q）和GENMED M引物R（Reagent R）到M管中
• 再分別加入xx微升GENMED補(bǔ)充液（Reagent N）（反應(yīng)總量為25微升）
• 即刻放進(jìn)微型臺式離心機(jī)瞬時離心5秒，速度為500g（或2000RPM；例如eppendorf 5415）
• 加入50微升PCR級礦物油（注意：參見注意事項9）
• 即刻進(jìn)行熱啟動PCR反應(yīng)：

• 反應(yīng)完畢后，移取5微升進(jìn)行1.8%瓊脂糖凝膠電泳
• 陽性條帶：轉(zhuǎn)化后非甲基型（U）――151 bp；轉(zhuǎn)化后甲基型（M）――150 bp

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 建議使用帶濾芯的槍頭，避免污染
• 一個特定基因的甲基化特異性PCR通常包括：轉(zhuǎn)化后甲基型（M）、轉(zhuǎn)化后非甲基型（U）
• 甲基化特異性PCR的引物設(shè)計原則： YIJI U引物F（Reagent O）、GENMED U引物R（Reagent P）、GENMED M引物F（Reagent Q）和GENMED M引物R（Reagent R）的信息如下：

• 通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測PCR擴(kuò)增后的結(jié)果。假如DNA樣品在修飾前是未甲基化的，那么僅僅“U”Primers將產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物；相反，已甲基化的DNA樣品僅僅用“M”Primer能被擴(kuò)增

• 組織樣品或雜合子樣品常常出現(xiàn)“U”和“M”同時呈現(xiàn)陽性；建議使用GENMED基因甲基化程度定量分析試劑盒（GMS20024.3）予以分析
• 根據(jù)用戶PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）
• 必要時，可以調(diào)整Tm溫度 
• 在－20℃冰箱里儲存的產(chǎn)品避免反復(fù)凍融
• 轉(zhuǎn)化后的DNA保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融
• 本公司同時提供系列基因甲基化分析試劑產(chǎn)品
• 本公司提供系列甲基化分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定轉(zhuǎn)化保證
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無核酶污染
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定反應(yīng)產(chǎn)量高