BrdU標記法組織石蠟切片細胞繁殖NBT顯色檢測試劑盒產品說明書（中文版）

 

主要用途

 

YIJI BrdU標記法組織石蠟切片細胞繁殖NBT顯色檢測試劑是一種旨在使用標準化的化學分離石蠟方法和免疫抗體顯色技術，即通過抗BrdU單克隆抗體以及堿性磷酸酶綴合物二抗，通過染料NBT/BCIP染色顯示紫藍色后，分析經過BrdU標記預處理（即使用溴脫氧尿嘧啶核苷替代脫氧胸腺嘧啶核苷整合到組織中合成的DNA鏈）的存檔中的石蠟包埋組織切片，其DNA合成水平的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。主要適用于各種BrdU標記預處理的組織（動物、人體、植物等）的DNA合成分析。廣泛用于細胞衰老、細胞凋亡的研究。產品嚴格無菌，即到即用，反應敏感，操作簡捷，性能穩定，顯色清晰。

 

技術背景

 

溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine；BrdU）是DNA前體胸腺嘧啶核苷類似物，通過競爭摻入DNA合成期（S期）細胞單鏈DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。由于組織細胞內無內源性BrdU存在，應用BrdU與胸腺嘧啶競爭摻入的強度，來分析細胞增殖狀況，包括增殖細胞的種類，增殖速度等細胞動力學問題。自82年Gratzer制備出抗BrdU單抗及標記檢測技術后，應用BrdU標記的敏感性已與氘胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）相似，而成為取代同位素的非放射性標記物之一。通常使用免疫組化方法定量或定性檢測其標記，反映細胞繁殖、細胞周期和DNA合成以及含量等。

 

產品內容

 

YIJI脫蠟液（Reagent A）         150毫升

YIJI補水液A（Reagent B）  100毫升

YIJI補水液B（Reagent C）  100毫升

YIJI補水液C（Reagent D）  100毫升

YIJI補水液D（Reagent E）  100毫升

YIJI清理液（Reagent F）       200毫升

YIJI固著液（Reagent G）         2毫升

YIJI修復液（Reagent H）         2毫升

YIJI變性液（Reagent I）         2毫升

YIJI中和液（Reagent J）         2毫升

YIJI封阻液（Reagent K）         2毫升

YIJI抗體液（Reagent L）         1毫升

YIJI二抗液（Reagent M）         1毫升

YIJI染色液（Reagent N）         2毫升

產品說明書    1份

 

保存方式

 

保存YIJI固著液（Reagent G）、YIJI修復液（Reagent H）、YIJI封阻液（Reagent K）、YIJI抗體液（Reagent L）、YIJI二抗液（Reagent M）和YIJI染色液（Reagent N）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；YIJI抗體液（Reagent L）和YIJI二抗液（Reagent M）嚴禁反復凍融； YIJI染色液（Reagent N）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

蓋玻片：用于封片孵育

小型染色缸：用于脫蠟處理

培養箱：用于組織細胞染色孵育

光學顯微鏡：用于組織細胞染色觀察

 

實驗步驟

 

• 脫蠟處理

 

• 取出待測的3至5微米厚的BrdU標記預處理過的石蠟包埋的組織切片（注意：石蠟包埋前，組織切片須用10％甲醛4℃條件下，固定16小時，此步很重要）
• （選擇步驟）放進80℃烘箱，孵育30分鐘
• （選擇步驟）室溫下靜置15分鐘
• 按下表依次放進小染色缸里孵育

染色缸	孵育時間
50毫升YIJI脫蠟液（Reagent A）	15分鐘
50毫升YIJI脫蠟液（Reagent A）	15分鐘
50毫升YIJI脫蠟液（Reagent A）	15分鐘
50毫升YIJI補水液A（Reagent B）	3分鐘
50毫升YIJI補水液B（Reagent C）	3分鐘
50毫升YIJI補水液C（Reagent D）	3分鐘
50毫升YIJI補水液D（Reagent E）	3分鐘

 

• 小心移去切片上的YIJI補水液D（Reagent E）
• 小心加上200微升YIJI清理液（Reagent F）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
• 小心移去切片上的YIJI清理液（Reagent F）

 

• 免疫染色處理

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里試劑盒中的試劑置入冰槽里融化。然后進行下列操作：

• 加上200微升－20℃預冷的YIJI固著液（Reagent G），鋪滿切片表面
• 置于冰槽里孵育15分鐘
• 小心抽去固著液
• 加上200微升YIJI修復液（Reagent H），鋪滿切片表面
• 室溫下孵育30分鐘
• 小心抽去修復液
• 加上200微升YIJI變性液（Reagent I），鋪滿切片表面
• 室溫下孵育30分鐘
• 小心抽去變性液
• 加入200微升YIJI中和液（Reagent J），鋪滿切片表面
• 小心抽去中和液
• 加上200微升YIJI封阻液（Reagent K），鋪滿切片表面
• 置于37℃培養箱里孵育30分鐘，保持濕潤
• 小心抽去封阻液
• 加上100微升YIJI抗體液（Reagent L），鋪滿切片表面
• 蓋上蓋玻片，置于37℃培養箱里孵育30分鐘（注意：避免氣泡）
• 小心移去蓋玻片，抽去YIJI抗體液（Reagent L）
• 加上200微升YIJI清理液（Reagent F），鋪滿切片表面
• 置于37℃培養箱里孵育5分鐘，保持濕潤
• 小心抽去清理液
• 重復實驗步18至20二次
• 加入100微升YIJI二抗液（Reagent M），鋪滿切片培養表面
• 蓋上新的蓋玻片，置于37℃培養箱里孵育30分鐘，避免光照（注意：避免氣泡）
• 小心移去蓋玻片，抽去YIJI二抗液（Reagent M）
• 加入200微升YIJI清理液（Reagent F），鋪滿切片培養表面
• 置于37℃培養箱里孵育5分鐘，保持濕潤
• 小心抽去YIJI清理液（Reagent F）
• 重復實驗步25至27二次
• 加入200微升YIJI染色液（Reagent N），鋪滿切片培養表面
• 置于37℃培養箱里孵育30分鐘，避免光照，或直至紫藍色呈現（注意：避免氣泡）
• 抽去YIJI染色液（Reagent N）
• 加入200微升YIJI清理液（Reagent F），鋪滿切片培養表面
• 小心抽去YIJI清理液（Reagent F）
• 重復實驗步32至33二次
• 蓋上蓋玻片或封片
• 即刻在光學顯微鏡下觀察：陽性細胞呈現紫藍色

 

注意事項

 

• 本產品為10次操作量
• 在整個操作過程中須戴手套，以防污染
• 動物BrdU標記預處理――方法一：30微克BrdU/克動物體重，靜脈注射，1小時后，手術取出組織或方法二：先手術取出組織，浸泡在BrdU液體里，37℃孵育60分鐘，清洗數次；然后進行切片處理（建議使用YIJI溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）溶液－GMS12194
• 石蠟包埋前，組織切片須用10％甲醛4℃條件下，固定16小時，否則造成樣品支離破碎
• 每次更換試劑溶液時，保持切片面基本晾干。空氣中晾干狀態為沒有水滴，呈濕潤狀態，可見反光
• 試劑溶液在切片表面時，避免有氣泡存在，同時確保鋪滿切片表面
• 孵育時，須避免光照
• 建議組織細胞染色完成后，即刻進行顯微鏡觀察 
• 本公司提供系列細胞凋亡和衰老檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定顯色清晰