非突觸體腦組織線粒體分離試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

YIJI非突觸體腦組織線粒體分離試劑是一種旨在從腦組織中分離出活性完整而高度純化的非突觸體線粒體細胞器的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適合于各種腦組織（人體和動物）的活性線粒體的制備。其制備物產量高，活性保存，純度可達99％。可以被用于線粒體酶活性、細胞凋亡、信號傳遞、代謝和蛋白組學等的研究。產品不含污染性蛋白水解酶和核酶，即到即用，性能穩定。

技術背景

線粒體細胞器的分離是現代細胞生物學研究的最常用的手段之一。從任何組織或細胞分離線粒體的技術方法基本上采用：第一，通過機械或化學方法破裂細胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細胞器；第三，通過高速差速離心獲得線粒體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的線粒體。動物腦組織中，包括前腦部位的腦皮層（cortex）或腦紋體（striatum）往往存在著非突觸體（non-synaptosome）和包含有髓軸突纖維（髓鞘；Myelin）和神經末梢（突觸體；synaptosome），結構的異源性導致細胞線粒體的生物學特征的差異，純化游離的腦組織線粒體（非突觸體腦組織線粒體）是必需的。

產品內容

YIJI清理液（Reagent A）   200毫升

YIJI裂解液（Reagent B）    20毫升

YIJI凈化液（Reagent C）     5毫升

YIJI強化液（Reagent D）     3毫升

YIJI保存液（Reagent E）    80毫升

YIJI高純液A（Reagent F）    20毫升

YIJI高純液B（Reagent G）    20毫升

產品說明書 1份

保存方式

保存YIJI凈化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；其余的保存在4℃冰箱里；YIJI高純液A（Reagent F）和YIJI高純液B（Reagent G），避免光照；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

3毫升針筒和18號針頭：用于抽取線粒體樣品帶

4℃（微型）臺式離心機：用于樣品操作

4℃超速離心機：用于分離細胞器成分和高質純化

DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞

實驗步驟

• 組織勻漿法

實驗開始前，將試劑盒里的YIJI凈化液（Reagent C）凍融，然后移出500微升YIJI凈化液（Reagent C）到2毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標記為YIJI裂解工作液。然后進行下列操作。

• 手術取出動物腦組織（腦皮層），并秤重以確定500毫克腦組織重量（實驗前最好使動物空腹12至24小時） 
• （選擇步驟）放進預冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入10毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗2次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進一個預冷的15毫升錐形離心管
• 加入預冷的2.5毫升YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用研磨棒勻化組織（約20下）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放入4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的組織細胞
• 放進－70℃冰箱里備用或放進冰槽繼續后續操作
• 移取2毫升YIJI離心液A（Reagent F）到6毫升超速離心管（注意：使用前搖勻YIJI高純液A（Reagent F））
• 輕輕加入2毫升的YIJI離心液B（Reagent G）在YIJI離心液A（Reagent F）上面，不要攪動YIJI離心液A（Reagent F）（注意：使用前搖勻YIJI高純液B（Reagent G））
• 輕輕加入2毫升組織上清液在YIJI高純液B（Reagent G）的上面，避免震動
• 放進4℃超速離心機離心45分鐘，速度為32000g
• 小心取出超速離心管：可見下層致密的棕色或乳黃色樣品帶（YIJI離心液A（Reagent F）和YIJI離心液B（Reagent G）的交界處）；可見中層為髓鞘和突觸體樣品帶以及上層少量細胞膜和細胞核樣品帶 
• 小心抽去線粒體樣品帶以上的液體
• 小心收集線粒體樣品帶到2毫升離心管（用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純非突觸體線粒體樣品帶
• 加入1至2毫升YIJI保存液（Reagent E）
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為16000g（13000RPM，例如eppendorf 5415D）
• 小心抽去上清液
• （選擇步驟）重復實驗步驟20至22一次
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent E），混勻
• 即刻移入到預冷的1.5毫升離心管
• 放進－70℃冰箱里保存

• 化學處理法

實驗開始前，將試劑盒里的YIJI凈化液（Reagent C）凍融，然后移出500微升YIJI凈化液（Reagent C）到2毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標記為YIJI裂解工作液。然后進行下列操作。

• 手術取出動物腦組織（腦皮層），并秤重以確定500毫克腦組織重量（實驗前最好使動物空腹12至24小時） 
• （選擇步驟）放進預冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入10毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗2次
• 移入一個液氮凍存管
• 即刻放入液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎組織（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入預冷的2.5毫升YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入預冷的250微升YIJI強化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次
• 加入預冷的2.5毫升YIJI保存液（Reagent E），輕輕搖動試管混勻
• 放入4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進－70℃冰箱里備用或放進冰槽繼續后續操作
• 移取2毫升YIJI離心液A（Reagent F）到6毫升超速離心管（注意：使用前搖勻YIJI高純液A（Reagent F））
• 輕輕加入2毫升的YIJI離心液B（Reagent G）在YIJI離心液A（Reagent F）上面，不要攪動YIJI離心液A（Reagent F）（注意：使用前搖勻YIJI高純液B（Reagent G））
• 輕輕加入2毫升組織上清液在YIJI高純液B（Reagent G）的上面，避免震動
• 放進4℃超速離心機離心45分鐘，速度為32000g
• 小心取出超速離心管：可見下層致密的棕色或乳黃色樣品帶（YIJI離心液A（Reagent F）和YIJI離心液B（Reagent G）的交界處）；可見中層為髓鞘和突觸體樣品帶以及上層少量細胞膜和細胞核樣品帶 
• 小心抽去線粒體樣品帶以上的液體
• 小心收集線粒體樣品帶到2毫升離心管（用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純非突觸體線粒體樣品帶
• 加入1至2毫升YIJI保存液(Reagent E)
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g（13000RPM，例如eppendorf 5415D）
• 小心抽去上清液
• （選擇步驟）重復實驗步驟25至27一次
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent E），混勻
• 即刻移入到預冷的1.5毫升離心管
• 放進－70℃冰箱里保存

注意事項

• 本產品為10次操作（500毫克動物腦組織/次）操作
• 所有操作均須在4℃或以下狀態下進行
• 建議使用足夠的組織
• 建議嚴格控制操作時間
• 通常500毫克腦組織的線粒體含量為25微克線粒體蛋白

6． 如果需要計量線粒體，稀釋后數分鐘內完成，否則線粒體將分解

7． 本產品所獲得的線粒體純度（可達到99％）和產量最為理想

8． 使用YIJI高純液A（Reagent F）和YIJI高純液A（Reagent G）前，須搖勻后加入；并注意避免污染母液

9． 根據超速離心管的大小調整YIJI高純液A（Reagent F）和YIJI高純液A（Reagent G）的使用量或在樣品上面加上石蠟油填滿

• 線粒體正常活性測定方法是： CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、細胞色素吸收峰譜等
• 線粒體內外膜完整測定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE活性和熒光JC染色
• 本公司提供線粒體套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、線粒體溶解等
• 本公司提供系列線粒體試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定分離的線粒體內外膜完整
• 本產品經鑒定不含污染性蛋白酶和核酶
• 本產品經鑒定分離的非突觸體腦組織線粒體純度達99％