植物高質純化線粒體分離試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

YIJI植物高質純化線粒體分離試劑是一種旨在從植物細胞或組織中分離出完整而高度純化的活性線粒體細胞器的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適合于各種新鮮植物組織，包括葉片（leaf）、谷粒（grain）、種子（seed）、以及培養細胞的高純線粒體的制備。其制備物產量高，活性保證，純度可達99％。可以被用于線粒體酶活性、細胞凋亡、信號傳遞、代謝和蛋白組學等的研究。產品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩定，分離產量和純度堪稱國際同類產品最佳。

 

技術背景

 

線粒體細胞器的分離是現代細胞生物學研究的最常用的手段之一。從任何組織或細胞分離線粒體的技術方法基本上采用：第一，通過機械或化學方法破裂細胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細胞器；第三，通過高速差速離心獲得線粒體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的線粒體。 

 

產品內容

 

YIJI清理液（Reagent A）   100毫升

YIJI裂解液（Reagent B）    40毫升

YIJI凈化液（Reagent C）    10毫升

YIJI活性液（Reagent D）   200微升

YIJI強化液（Reagent E）     5毫升

YIJI保存液（Reagent F）   100毫升

YIJI高純液（Reagent G）    55毫升

產品說明書 1份

 

保存方式

 

保存YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，YIJI高純液（Reagent G），避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于線粒體初步制備物的存放

50毫升錐形離心管：用于細胞或組織收集后離心或清洗的容器

1.5毫升離心管：用于保存線粒體的容器

4℃臺式離心機：用于沉淀細胞

4℃超速離心機：用于分離細胞器成分和高質純化

DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞

 

 

實驗步驟

 

一、植物組織線粒體分離（組織勻漿法）

 

實驗開始前，將試劑盒里的YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent D）凍融，然后移取20微升YIJI活性液（Reagent D）、 1毫升YIJI凈化液（Reagent C）和4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為YIJI裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進行下列操作。

 

• 準備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 
• （選擇步驟）放進預冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入10毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進一個預冷的15毫升錐形離心管
• 加入預冷的5毫升YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿幫勻化組織（約80下）（注意：參見注意事項9）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管，放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管（如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復離心5分鐘一次，速度為3000g）——此步驟去除細胞壁、淀粉顆粒、細胞核和未溶解的細胞以及完整質體等殘渣
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀顆粒
• 放進－70℃冰箱里備用或放進冰槽里繼續后續操作
• 移取5.5毫升的YIJI高純液（Reagent G）到6毫升超速離心管（注意：使用前搖勻YIJI高純液(Reagent G)）
• 輕輕加入500微升線粒體混勻液在YIJI高純液（Reagent G）的上面，避免震動
• 放進4℃超速離心機離心45分鐘，速度為40000g
• 小心取出超速離心管：可見下端棕色或乳黃色樣品帶（注意：在其上端可能有溶酶體樣品帶） 
• 小心抽去線粒體樣品帶以上的液體
• 小心收集線粒體樣品帶到2毫升離心管（用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純線粒體樣品帶
• 加入1至2毫升YIJI保存液（Reagent F）
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液
• （選擇步驟）重復實驗步驟21至23一次
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent F），混勻
• 即刻移入到預冷的1.5毫升離心管
• 放進－70℃冰箱里保存

 

二、植物組織線粒體分離（化學處理法）

 

實驗開始前，將試劑盒里的YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent D）凍融，然后移取20微升YIJI活性液（Reagent D）、 1毫升YIJI凈化液（Reagent C）和4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為YIJI裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進行下列操作。

 

• 準備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 
• （選擇步驟）放進預冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入10毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入預冷的5毫升YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入預冷的500微升YIJI強化液（Reagent E）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項10）
• 加入預冷的5毫升YIJI保存液（Reagent F），輕輕搖動試管混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管（如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復離心5分鐘一次，速度為3000g）——此步驟去除細胞壁、淀粉顆粒、細胞核和未溶解的細胞以及完整質體等殘渣
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀顆粒
• 放進－70℃冰箱里備用或放進冰槽里繼續后續操作
• 移取5.5毫升的YIJI高純液（Reagent G）到6毫升超速離心管（注意：使用前搖勻YIJI高純液(Reagent G)）
• 輕輕加入500微升線粒體混勻液在YIJI高純液（Reagent G）的上面，避免震動
• 放進4℃超速離心機離心45分鐘，速度為40000g
• 小心取出超速離心管：可見下端棕色或乳黃色樣品帶（注意：在其上端可能有溶酶體樣品帶） 
• 小心抽去線粒體樣品帶以上的液體
• 小心收集線粒體樣品帶到2毫升離心管（用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純線粒體樣品帶
• 加入1至2毫升YIJI保存液（Reagent F）
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液
• （選擇步驟）重復實驗步驟27至29一次
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent F），混勻
• 即刻移入到預冷的1.5毫升離心管
• 放進－70℃冰箱里保存

 

 

 

三、植物細胞或原生質體線粒體分離（細胞勻漿法）

 

實驗開始前，將試劑盒里的YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent D）凍融，然后移取20微升YIJI活性液（Reagent D）、 1毫升YIJI凈化液（Reagent C）和4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為YIJI裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進行下列操作。

 

• 準備5 X 10⁷植物細胞或原生質體
• 移入一個50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入10毫升預冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細胞
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預冷的5毫升YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群
• 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿幫勻化細胞（約80下）（注意：參見注意事項9）
• 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管，放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管（如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復離心5分鐘一次，速度為3000g）——此步驟去除細胞壁、淀粉顆粒、細胞核和未溶解的細胞以及完整質體等殘渣
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀顆粒
• 放進－70℃冰箱里備用或放進冰槽里繼續后續操作
• 移取5.5毫升的YIJI高純液（Reagent G）到6毫升超速離心管（注意：使用前搖勻YIJI高純液(Reagent G)）
• 輕輕加入500微升線粒體混勻液在YIJI高純液（Reagent G）的上面，避免震動
• 放進4℃超速離心機離心45分鐘，速度為40000g
• 小心取出超速離心管：可見下端棕色或乳黃色樣品帶（注意：在其上端可能有溶酶體樣品帶） 
• 小心抽去線粒體樣品帶以上的液體
• 小心收集線粒體樣品帶到2毫升離心管（用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純線粒體樣品帶
• 加入1至2毫升YIJI保存液（Reagent F）
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液
• （選擇步驟）重復實驗步驟23至25一次
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent F），混勻
• 即刻移入到預冷的1.5毫升離心管
• 放進－70℃冰箱里保存

 

四、植物細胞或原生質體線粒體分離（化學處理法）

 

實驗開始前，將試劑盒里的YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent D）凍融，然后移取20微升YIJI活性液（Reagent D）、 1毫升YIJI凈化液（Reagent C）和4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為YIJI裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進行下列操作。

 

• 準備5 X 10⁷植物細胞或原生質體
• 移入一個50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入10毫升預冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細胞
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預冷的5毫升YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• （選擇步驟）超聲波處理1分鐘
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入預冷的500微升YIJI強化液（Reagent E）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項10）
• 加入預冷的5毫升YIJI保存液（Reagent F），輕輕搖動試管混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管（如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復離心5分鐘一次，速度為3000g）——此步驟去除細胞壁、淀粉顆粒、細胞核和未溶解的細胞以及完整質體等殘渣
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀顆粒
• 放進－70℃冰箱里備用或放進冰槽里繼續后續操作
• 移取5.5毫升的YIJI高純液（Reagent G）到6毫升超速離心管（注意：使用前搖勻YIJI高純液(Reagent G)）
• 輕輕加入500微升線粒體混勻液在YIJI高純液（Reagent G）的上面，避免震動
• 放進4℃超速離心機離心45分鐘，速度為40000g
• 小心取出超速離心管：可見下端棕色或乳黃色樣品帶（注意：在其上端可能有溶酶體樣品帶） 
• 小心抽去線粒體樣品帶以上的液體
• 小心收集線粒體樣品帶到2毫升離心管（用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純線粒體樣品帶
• 加入1至2毫升YIJI保存液（Reagent F）
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液
• （選擇步驟）重復實驗步驟28至30一次
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent F），混勻
• 即刻移入到預冷的1.5毫升離心管
• 放進－70℃冰箱里保存

 

 

注意事項

 

• 本產品為10次操作（1克植物組織或5 X 10⁷細胞）
• 實際操作的植物組織重量或細胞量與試劑使用量按比例調整：例如200毫克植物組織：試劑用量是標準用量的五分之一
• 所有操作均須在4℃或以下狀態下進行
• 操作時，須戴手套
• 建議無菌操作，避免污染母液，尤其是YIJI裂解液（Reagent B）和YIJI保存液（Reagent E）
• 建議使用足夠的組織或細胞量
• 建議植物組織使用組織勻漿器操作；德國的BRAUN細胞勻漿器最為理想
• 建議嚴格控制操作時間
• 通常勻化次數為80下（或細胞顆粒群/組織塊狀消失為止）達到80％的細胞裂解為理想狀態，但不同的組織或細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現發亮的圓環。低于50％可以增加勻化次數
• 通常孵育5分鐘達到80％的細胞裂解為理想狀態，但不同的組織或細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細胞裂解程度：完整細胞呈現發亮的圓環。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數
• YIJI裂解液（Reagent B）具有吸附去除酚類物質的作用
• 建議使用40000g以上離心速度；如果沒有條件，則不能低于30000g，離心時間增加為60至90分鐘

13． 使用YIJI高純液（Reagent G）前，須搖勻后加入；并注意避免污染母液

• 根據超速離心管的大小調整YIJI高純液（Reagent G）的使用量或在樣品上面加上石蠟油填滿
• 不同組織，其線粒體含量不同；通常1克植物組織的線粒體含量為10至50微克線粒體蛋白

16． 如果需要計量線粒體，稀釋后數分鐘內完成，否則線粒體將分解

17． 本產品可以獲得99％純度的線粒體

• 線粒體正常活性測定方法是： CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、細胞色素吸收峰譜等
• 線粒體內外膜完整測定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE活性和熒光JC染色
• 本公司提供線粒體套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、線粒體溶解等
• 本公司提供系列植物分析試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定分離的線粒體內外膜完整
• 本產品經鑒定分離的線粒體維持正常活性
• 本產品經鑒定不含污染性蛋白酶和核酶