雙參數(shù)細(xì)胞周期S期流式細(xì)胞分析試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

雙參數(shù)細(xì)胞周期S期流式細(xì)胞分析試劑是一種旨在使用溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）和DNA含量雙重參數(shù)在細(xì)胞流式儀下，分析和區(qū)分細(xì)胞周期S期的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。主要適用于各種活體細(xì)胞（動物、人體、植物等）的細(xì)胞周期S期分析。廣泛用于細(xì)胞繁殖，包括細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，反應(yīng)敏感，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

細(xì)胞周期是評價細(xì)胞代謝、生理和病理狀況的重要指標(biāo)。通過DNA結(jié)合染料這一單一參數(shù)（univariate parameter），借助細(xì)胞流式儀，測定出DNA含量，根據(jù)DNA含量隨著細(xì)胞周期的不同而發(fā)生變化，來確定和區(qū)別細(xì)胞周期的不同階段，形成三種不同的細(xì)胞群，包括G0/G1、S、G2/M。而使用雙參數(shù)（bivariate parameter），即特異性細(xì)胞周期表達(dá)蛋白和DNA含量，則可以區(qū)分G0和G1，G2和M。其中細(xì)胞周期素（cyclins）是細(xì)胞周期進(jìn)程機(jī)制的關(guān)鍵元素和標(biāo)志（landmark）。溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine；BrdU）是DNA前體胸腺嘧啶核苷類似物，通過競爭摻入DNA合成期（S期）細(xì)胞單鏈DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶，來分析細(xì)胞周期S期分布情況。流式細(xì)胞術(shù)（FLOW CYTOMETRY）是七十年代發(fā)展起來的集計算機(jī)、激光、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)為一體的高科學(xué)技術(shù)。

產(chǎn)品內(nèi)容

標(biāo)記液（Reagent A）         300微升

清理液（Reagent B）    100毫升

固著液（Reagent C）     50毫升

修復(fù)液（Reagent D）     10毫升

變性液（Reagent E）     10毫升

中和液（Reagent F）     10毫升

抗體液（Reagent G）    700微升

封阻液（Reagent H）     40毫升

熒光液（Reagent I）    600微升

復(fù)染液（Reagent J） 5毫升

產(chǎn)品說明書 1份

保存方式

保存標(biāo)記液（Reagent A）、固著液（Reagent C）、修復(fù)液（Reagent D）、抗體液（Reagent G）、封阻液（Reagent H）、熒光液（Reagent I）和復(fù)染液（Reagent J）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；抗體液（Reagent G）和熒光液（Reagent I）嚴(yán)禁反復(fù)凍融；標(biāo)記液（Reagent A）、熒光液（Reagent I）和復(fù)染液（Reagent J），避免光照；有效保證6月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細(xì)胞脫離

完全細(xì)胞培養(yǎng)液（12052）：用于中和胰蛋白酶的處理

15毫升錐形離心管：用于細(xì)胞收集的操作

1.5毫升離心管：用于細(xì)胞染色的容器

臺式離心機(jī)：用于細(xì)胞收集的操作

微型臺式離心機(jī)：用于細(xì)胞收集的操作

細(xì)胞流式儀：用于細(xì)胞熒光分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里試劑盒中的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作：

• 準(zhǔn)備1個6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞（1 X 10⁶細(xì)胞/3毫升培養(yǎng)液/孔）
• 加入30微升標(biāo)記液（Reagent A），避免光照
• 輕輕搖動培養(yǎng)板，混勻
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1小時，避免光照
• 小心抽去含有標(biāo)記液（Reagent A）細(xì)胞培養(yǎng)液
• 加入2毫升清理液（Reagent B），鋪滿培養(yǎng)孔表面
• 小心抽去清理液（Reagent B）
• 重復(fù)實驗步驟6至7一次
• 加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1分鐘
• 加入3毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移取細(xì)胞混勻液到15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為400g（或1500rpm，例如EPPENDORF 5810R）
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升清理液（Reagent B），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為400g（或1500rpm，例如EPPENDORF 5810R）
• 小心抽去上清液
• 加入200微升清理液（Reagent B），混勻細(xì)胞顆粒群
• （選擇步驟）細(xì)胞計數(shù)
• 同時準(zhǔn)備1個－20℃預(yù)冷的新的15毫升錐形離心管
• 加入5毫升－20℃預(yù)冷的固著液（Reagent C）
• 用200微升槍頭一滴一滴加入細(xì)胞懸液到含有預(yù)冷的固著液（Reagent C）里，保持輕度渦旋震蕩
• 置于冰槽里孵育15分鐘
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為400g（或1500rpm，例如EPPENDORF 5810R）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升修復(fù)液（Reagent D），上下抽吸混勻
• 轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管
• 室溫下孵育30分鐘
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 用手指輕彈管底，使細(xì)胞顆粒松動
• 加入1毫升變性液（Reagent E）
• 渦旋震蕩3秒
• 室溫下孵育30分鐘
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 用手指輕彈管底，使細(xì)胞顆粒松動
• 加入1毫升中和液（Reagent F）
• 渦旋震蕩3秒
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 用手指輕彈管底，使細(xì)胞顆粒松動
• 加入70微升抗體液（Reagent G），充分混勻
• 室溫下孵育30分鐘
• 加入1毫升封阻液（Reagent H），混勻
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 用手指輕彈管底，使細(xì)胞顆粒松動
• 加入60微升熒光液（Reagent I），充分混勻
• 室溫下孵育45分鐘，避免光照
• 加入1毫升封阻液（Reagent H），混勻
• 渦旋震蕩3秒
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 重復(fù)實驗步驟51至54二次
•  加入500微升復(fù)染液（Reagent J），用槍頭充分混勻
• 移入到細(xì)胞流式儀專用測試管（可放進(jìn)4℃冰箱里待測），避免光照
• 即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析：波長488nm氬離子激光器，觀察50000個細(xì)胞以上
• 建立地形圖或散點(diǎn)圖以及直方圖分析

• 根據(jù)地形圖或散點(diǎn)圖，縱坐標(biāo)Y軸為FL1（BrdU綠色熒光），橫坐標(biāo)X軸為FL2（PI紅色熒光），分析如下：

• 根據(jù)橫坐標(biāo)X軸的DNA指數(shù)（DNA Index；DI）進(jìn)行區(qū)域窗口劃分（見參考圖）
• 確定S期區(qū)域窗口或直接確定總細(xì)胞數(shù)
• 計算（S期區(qū)域窗口的）BrdU陽性細(xì)胞數(shù)：S期細(xì)胞數(shù)
• 獲得S期在細(xì)胞周期中的百分比
• 獲得單個區(qū)域窗口的Y軸的BrdU平均熒光讀數(shù)
• 根據(jù)BrdU平均熒光讀數(shù)，構(gòu)建S細(xì)胞周期動態(tài)變化曲線――縱坐標(biāo)為BrdU，橫坐標(biāo)為時間或藥物濃度等
• 參考圖如下：

注意事項

• 本產(chǎn)品為10次操作量
• 在整個操作過程中須戴手套，以防污染
• 孵育時，必須避免光照
• 建議不用抗體液（Reagent G），作為陰性對照
• 建議細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析。如果放進(jìn)4℃冰箱里待測，不要超過3天
• 細(xì)胞流式儀分析前，須混勻內(nèi)容物
• 細(xì)胞檢測量不得少于10000個
• 檢測時，須彌補(bǔ)電子補(bǔ)償，以去除雙重參數(shù)的光譜重疊
• 告知流式儀技術(shù)員有關(guān)細(xì)胞類型
• 本公司提供系列細(xì)胞周期檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定標(biāo)記清晰