細菌趨化作用（chemotaxis）軟瓊脂檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

細菌趨化作用（chemotaxis）軟瓊脂檢測試劑是一種旨在采用半固體瓊脂糖，構(gòu)建化學趨化物（chemoattractant）彌散形成濃度差異的空間，觀察細菌群移現(xiàn)象、環(huán)形（ring）標志，以及空白區(qū)域等外觀形態(tài)，進行分析細菌趨化作用的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其特別適用于各種細菌以及突變型、轉(zhuǎn)基因處理細菌的趨化性研究和篩選，同時檢測趨化因子和抑制因子的作用。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，性能穩(wěn)定，操作簡便，重復一致。

 

技術(shù)背景

 

趨化性（chemotaxis）是指細胞或生物體對于介質(zhì)中的特定化學分子的濃度差異形成的刺激所引起的趨向運動。許多種類的游動細胞具有趨化性，例如細菌和阿米巴細胞朝著食物源移動；人體免疫細胞包括巨噬細胞和中性白細胞朝著外來入侵細胞移動。此外，許多在發(fā)育進程中發(fā)生的形態(tài)變化與細胞向化學物質(zhì)濃度差異趨化移動相關(guān)。細菌趨化性是細胞感受化學信號，由膜結(jié)合受體連接到細胞內(nèi)傳遞機制，通過鞭毛運動產(chǎn)生相應(yīng)的移動反應(yīng)。細菌趨化性檢測包括時相（temporal）和空間（spatial）梯度檢測。其中軟瓊脂群移平板檢測（soft-agar swarming plate assay）是空間梯度分析的常用方法。作為半固體介質(zhì)之一的瓊脂糖（Agarose），構(gòu)建化學趨化物（chemoattractant）彌散形成濃度差異的空間，觀察細菌群移現(xiàn)象、環(huán)形（ring）標志，以及空白區(qū)域等外觀形態(tài)，進一步分析野生型和突變型細菌，以及化學引誘分子（chemoattractant）和化學排斥分子（chemorepellent）的趨向變化。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

通用介質(zhì)液（Reagent A） 100毫升

選擇介質(zhì)液（Reagent B） 100毫升

重懸液（Reagent C）  10毫升

產(chǎn)品說明書   1份

 

保存方式

 

保存在4℃的冰箱里；有效保證6月 

 

用戶自備

 

50毫升錐形離心管：用于混勻介質(zhì)液的容器

100mm培養(yǎng)皿：用于細菌趨化實驗的容器

恒溫水浴：用于試劑保溫

微型臺式離心機：用于樣品操作

培養(yǎng)箱：用于細菌培養(yǎng)

量尺：用于測量細菌移動距離

 

實驗步驟

 

一、 瓊脂平板準備

 

1． 將通用介質(zhì)液（Reagent A）或選擇介質(zhì)液（Reagent B）置于微波爐里加熱溶化（注意：避免溢出）

2． 放進50℃恒溫水浴

3． 移出20毫升通用介質(zhì)液（Reagent A）或選擇介質(zhì)液（Reagent B）到50毫升錐形離心管

4． 即刻加入1毫升用戶自備的待測的化學趨化分子

5． 上下傾倒混勻

6． 最快速度倒入100mm培養(yǎng)皿

7． 均勻鋪滿整個底面，避免氣泡產(chǎn)生

8． 置于室溫下至少2小時或4℃冰箱里1小時，使膠體凝固

9． 倒置培養(yǎng)皿，在其外底面，用尺和標記筆做好標記――根據(jù)檢測要求設(shè)置如下：

1）一板多點

2）一板單點

  

 

二、 細菌準備

 

1． 準備10毫升過夜生長的新鮮的培養(yǎng)細菌（OD590=0.4，達5 X 10⁷細菌/毫升）

2． 移取1毫升到新的1.5毫升離心管

3． 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g

4． 小心抽掉上清液

5． 加入1毫升重懸液（Reagent C），混勻

6． 置于冰槽里備用

 

三、 趨化實驗

 

1． 加入10微升上述準備的待測細菌到相應(yīng)的標記點位

2． 室溫下靜置30分鐘

3． 小心放進35℃培養(yǎng)箱孵育6至8小時（一板多點）或24至48小時（一板單點），保持培養(yǎng)箱濕潤

4． 觀察細菌群移現(xiàn)象：建議每隔2小時觀察1次

5． 直至出現(xiàn)趨化環(huán)

6． 結(jié)果分析：

1) 使用量尺進行細菌移動距離測量：細菌點和細菌趨化環(huán)之間的距離

2) 細菌趨化環(huán)密度計量：包括所有移動細胞，或設(shè)定移動區(qū)域的細胞

7． 構(gòu)建距離、密度、時間、趨化物濃度包括空白對照的關(guān)系曲線

8． 確定趨化系數(shù)（chemokinesis coefficiency）：趨化物濃度和細菌移動密度的關(guān)系曲線的斜率

 

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為10次（100mm培養(yǎng)皿）操作
• 其它實際操作的培養(yǎng)皿大小與試劑使用量按比例調(diào)整
• 所有培養(yǎng)操作和使用工具均須在嚴格無菌狀態(tài)下進行
• 操作時須戴手套
• 建議使用系列趨化物濃度進行檢測比較；注意一板只能進行一種濃度檢測
• 通常不同細菌分析比較，可以采用一板多點
• 通用介質(zhì)液（Reagent A）常用于不同細菌（例如突變菌等）的比較分析或明確趨化分子的檢測；更適合于排斥分子的分析
• 選擇介質(zhì)液（Reagent B）常用于單一趨化分子或未知趨化分子的分析
• 建議待測細菌量為10⁵細菌/樣品點 
• 建議細菌為新鮮培養(yǎng)
• 已經(jīng)鋪板但暫時保存的含凝膠體的培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿，用PARAFILM密封，在4℃冰箱里儲存
• 操作時小心輕柔，避免膠體脫位
• 通常細菌移動為4至24小時之間；注意隨時觀察，避免細菌移動過快，失去分析良機
• 排斥分子檢測可以持續(xù)觀察至48小時終止
• 通用介質(zhì)液（Reagent A）的正常細菌的趨化性參考圖像

 

 

 

 

 

• 選擇介質(zhì)液（Reagent B）的正常細菌的單一趨化分子的趨化性參考圖

 

• 本公司提供系列細胞趨化分析試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無病毒和支原體污染
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定重復率好