通用型蛋白免疫共沉淀（蛋白A樹脂）試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

通用型蛋白免疫共沉淀（蛋白A樹脂）試劑是一種旨在通過化學處理方法萃取并維護細胞或組織樣品中的蛋白復合物，從而運用單一特異抗體結合免疫沉淀目標蛋白以及與之相互作用的結合蛋白，然后由蛋白質A（PROTEIN-A）樹脂捕獲抗原抗體復合物，洗脫產物進行后續分析的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于后續蛋白電泳分析、西方（WESTERN BLOT）雜交檢測和蛋白多肽序列分析等。廣泛應用于蛋白質相互作用、生化特征、酶活性、后轉錄修飾、蛋白表達的研究等。產品即到即用，性能穩定，操作便捷，反應敏感，結合顯著，重復性好。

技術背景

蛋白免疫共沉淀方法是運用抗原抗體原理，識別和量化目標蛋白，以及檢測其物理特性，進一步研究蛋白質－蛋白質相互作用的經典方法：用于分析后轉錄修飾、蛋白表達和酶活性等。免疫共沉淀技術通過四大步驟實現：第一，細胞或組織蛋白復合物樣品的萃取和活性維護；第二，運用特異蛋白之抗體，免疫共沉淀細胞或組織裂解懸液中目標蛋白；第三，蛋白質A樹脂與蛋白－抗體復合物結合沉淀；第四，西方雜交分析目標蛋白。

產品內容

清理液（Reagent A） 100毫升

裂解液（Reagent B）       10毫升

結合液（Reagent C）      500微升

緩沖液（Reagent D）  30毫升

上樣液（Reagent E） 500微升

產品說明書       1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）和結合液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；上樣液（Reagent E）避免光照，有效保證6月

用戶自備

特異抗體：用于目標蛋白的結合

1.5毫升離心管：用于樣品反應操作和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

細胞刮脫棒：用于脫離細胞

震蕩器：用于混勻反應物

4℃微型臺式離心機：用于沉淀樣品

4℃臺式離心機：用于沉淀樣品

平式搖蕩儀或搖床：用于孵育和混勻反應

實驗步驟

• 樣品制備

（一）貼壁細胞裂解懸液制備

• 準備100mm細胞培養皿或75cm²細胞培養瓶的細胞，直至生長到80至90％鋪滿率（5 X 10⁶細胞）
• 小心抽去上清液
• 小心加入10毫升清理液（Reagent A），鋪滿生長表面
• 小心抽去清理液（Reagent A）（注意：保留1毫升用于下一步操作）
• 即刻用細胞刮脫棒刮脫細胞
• 轉移到1.5毫升離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升預冷的裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育15分鐘
• 每隔5分鐘渦旋震蕩5秒
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移取上清液到1.5毫升離心管
• 小心移取10微升進行蛋白定量測定（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 放進冰槽里備用或保存在－70℃冰箱里

（二）懸浮細胞裂解懸液制備

• 準備75cm²細胞培養瓶的懸浮細胞（5 X 10⁶細胞）
• 轉移到50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入10毫升清理液（Reagent A），混勻
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升預冷的裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育15分鐘
• 每隔5分鐘渦旋震蕩5秒
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移取上清液到1.5毫升離心管
• 小心移取10微升進行蛋白定量測定（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 放進冰槽里備用或保存在－70℃冰箱里
  • 組織裂解懸液制備

• 手術取出動物組織，并秤重以確定組織重量
• （選擇步驟）放進預冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入適量的（1克組織需要10毫升）清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 或置于液氮管過夜，次日取出后，即刻（最快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
• 放進15毫升錐形離心管
• 加入1毫升預冷的裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育15分鐘
• 每隔5分鐘渦旋震蕩5秒
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移取上清液到1.5毫升離心管
• 小心移取10微升進行蛋白定量測定（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 放進冰槽里備用或保存在－70℃冰箱里

• 免疫沉淀反應

• 移取250微升上述制備的裂解懸液樣品（總量為250微克總蛋白）到1.5毫升離心管
• 加入10微升用戶自備的特異抗體（多克隆抗體；總量為2微克）
• 放進冰槽里孵育1小時，速度為100RPM（注意：可以延長孵育至16小時）
• 加入50微升結合液（Reagent C）
• 平放置于4℃搖床孵育1小時，速度為100RPM（注意：可以延長孵育至4小時）
• 放進4℃微型臺式離心機離心2分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升緩沖液（Reagent D），充分混勻
• 放進4℃微型臺式離心機離心2分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 重復實驗步驟8至10二次（注意：確保沒有液體殘留）
• 加入50微升上樣液（Reagent E），混勻
• 煮沸5分鐘
• 室溫下靜置10分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心2分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
• 放進冰槽里備用或保存在－70℃冰箱里
• 繼續后續西方雜交（WESTERN BLOT）實驗

注意事項

• 本產品為10次（5 X 10⁶細胞/次或1克組織/次）操作
• 操作時，須戴手套
• 所有操作均須在4℃狀態進行
• 本產品使用變性裂解處理；用戶可以根據需要，使用非變性裂解處理；建議使用非變性裂解液II－12054.2B
• 用戶可以萃取細胞核蛋白，用于免疫沉淀
• 本產品使用蛋白質A樹脂，適合人體IgG1/2/4亞型，小鼠IgG1/2a/2b/3亞型和IgA，大鼠Ig1/G2c亞型，以及兔多克隆抗體，還有牛、馬、豚鼠、倉鼠、豬等抗體
• 建議使用多克隆兔源抗體為佳
• 如果非特異性反應明顯，建議加入2微克非相關性抗體和30微升結合液（Reagent C）到待測的裂解懸液進行封閉預處理1小時（4℃狀態），離心后取上清進行后續結合反應
• 用戶可以使用0.1摩爾甘氨酸（GLYCINE）緩沖液（pH2.5）替代上樣液（Reagent E）進行洗脫，可以減少非特異性洗脫
• 在－70℃冰箱里儲存的產品避免反復凍融
• 本公司提供系列免疫沉淀試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定不含污染性蛋白酶