氨基萘三磺酸（ANTS）標記熒光輔助糖分子電泳（FACE）檢測試劑盒

產品說明書（中文版）

 

主要用途

 

氨基萘三磺酸（ANTS）標記熒光輔助糖分子電泳（FACE）檢測試劑是一種旨在通過熒光探針氨基萘三磺酸和糖分子的末端醛基的結合，經過凝膠電泳顯示的熒光條帶，來識別和定量糖分子成分和豐度的權威而經典的技術方法。該技術經過精心改良傳統方法、成功實驗證明的。主要適用于各種寡聚糖的分離檢測。產品即到即用，操作簡捷，性能穩定，熒光清晰，高度敏感。

 

技術背景

 

熒光輔助糖分子電泳（Fluorophore Assisted Carbohydrate Electrophoresis；FACE）是一種通過熒光染料，標記在糖分子上，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳，依據分子量的大小，高度分離寡聚糖糖分子，識別和定量寡聚糖中單糖分子的檢測系統，以分析寡聚糖的特性、變化程度和單糖成分組成。氨基萘三磺酸（8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulphonate；ANTS）是一種具有高度電荷的熒光染料（激發波長320nm，散發波長520nm），與糖分子的末端醛基（aldehyde）結合，便于在凝膠電泳上清晰顯示，高度敏感，可以檢測到2皮摩爾的糖分子。

 

產品內容

 

標記液（Reagent A）    5管

稀釋液（Reagent B）       500微升

反應液（Reagent C）    5管

溶解液（Reagent D）       500微升

上樣液（Reagent E）    1毫升

膠體液（Reagent F）  150毫升

凝結液（Reagent G）    4毫升

促進液（Reagent H）  400微升

上膠液（Reagent I）   15毫升

電泳液（Reagent J）  250毫升

產品說明書    1份

 

保存方式

 

保存標記液（Reagent A）、反應液（Reagent C）和凝結液（Reagent G）在-20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品標記操作的容器

15毫升錐形離心管：用于上膠體溶液配制的容器

50毫升錐形離心管：用于膠體溶液配制的容器

500毫升燒杯：用于配制工作液的容器

無離子水：用于稀釋試劑溶液

恒溫水槽：用于反應孵育

離心濃縮儀：用于樣品干燥

電泳儀：用于糖分子電泳分離

UV自動成像儀或PHOSPHORIMAGE：用于電泳染色記錄和分析

 

實驗步驟

 

• 樣品準備

 

• 準備好待測樣品：10微克糖蛋白或30皮摩爾寡聚糖
• 如果檢測糖蛋白中的寡聚糖分子，建議使用生物酶法分離寡聚糖分子
• 如果檢測糖蛋白或寡聚糖中的單糖分子，建議使用肼解法：即使用2摩爾TFA水解中性糖分子或使用4摩爾鹽酸水解氨基糖分子

 

• 熒光標記

 

實驗開始前，從-20冰箱里分別取出1管標記液（Reagent A）和反應液（Reagent C），置于室溫下均衡。移取20微升稀釋液（Reagent B）到標記液（Reagent A）管里，混勻，標記為標記工作液，避免光照；移取40微升溶解液（Reagent D）到反應液（Reagent C）管里，混勻，標記為反應工作液，避免光照。然后進行下列操作。

 

• 移取100微升待測樣品（10微摩爾/升）到1.5毫升離心管
• 放進離心濃縮儀離心干燥
• 加入5微升標記工作液
• 加入5微升反應工作液
• 用20微升槍頭抽吸混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育16小時，避免光照
• 放進離心濃縮儀離心干燥
• 即刻加入50微升上樣液（Reagent E），混勻
• （選擇步驟）如果暫時停止，可以保存在-70℃冰箱里
• 繼續后續操作

 

• 垂直電泳分析

 

• 移出30毫升膠體液（Reagent F）到50毫升錐形離心管里
• 加入600微升凝結液（Reagent G）
• 加入60微升促進液（Reagent H）
• 混勻后，即刻移入玻璃槽，避免氣泡
• 在室溫下孵育45分鐘，或直至膠體凝結
• 移出3毫升上膠液（Reagent I）到15毫升錐形離心管里
• 加入100微升凝結液（Reagent G）
• 加入10微升促進液（Reagent H）
• 混勻后，即刻移入玻璃槽，避免氣泡
• 插入10孔梳
• 在室溫下孵育45分鐘，或直至膠體凝結
• 移取50毫升電泳液（Reagent J）到500毫升容器里，加入450毫升用戶自備的無離子水，混勻后，標記為電泳工作液
• 加入適量的電泳工作液到電泳槽里
• 拔出10孔梳
• 用1毫升槍頭清洗樣品孔槽
• 上樣：10微升（注意：20皮摩爾/微升）
• 在4℃環境下電泳3小時，穩定電流為15毫安，直至溴酚藍（Bromophenol Blue）染料移動到膠體下三分之二處
• 拆除電泳裝置，取出電泳玻璃板塊
• 分離玻璃板快，切除膠底
• 即刻置于UV自動成像儀或PHOSPHORIMAGE下成像記錄，并測算條帶熒光強度
• 根據已知標準對照的上樣濃度和熒光強度，計算樣品的寡聚糖或單糖含量和相對豐度（relative abundance）

 

• 單糖濃度

 

[（待測樣品熒光強度 X樣品稀釋倍數）÷已知標準樣品熒光強度] X已知標準樣品上樣濃度（皮摩爾/微升）

 

• 單糖含量

 

根據單糖分子量換算成微克

 

• 寡聚糖

 

累加所有單糖的含量得出糖蛋白中的寡聚糖總量

 

4）計算百分比

 

注意事項

 

• 本產品為5次操作（包括20次標記，5次電泳）
• 操作時，須戴手套
• 建議樣品上樣量為200皮摩爾/10微升
• 標記工作液和反應工作液配制后，可以保存在-70℃冰箱里2周；使用前，如果有結晶析出，可以溫育溶解
• 用戶可以使用牛胎球蛋白（bovine fetuin）作為糖蛋白標準陽性對照
• 用戶可以使用N-乙酰乳糖胺（N-acetyllactosamine）、甘露糖（mannose）、巖藻糖（fucose）、半乳糖（galactose）、葡萄糖（glucose）等任何一個或組合作為單糖分子標準陽性對照
• 通常恒定電流15毫安運行3至6小時；30毫安運行1.5至3小時，但是膠體大小等因素會影響實際運行時間；建議根據示蹤染料的位置決定是否終止電泳
• 通常電泳的電壓變化由100伏至1000伏范圍
• 本公司提供系列糖蛋白分析試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定熒光清晰