p21 ^{Waf1/Cip1/Sdi1}蛋白表達西方雜交分析試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

p21 ^{Waf1/Cip1/Sdi1}蛋白表達西方雜交分析試劑是一種旨在將細胞或組織中總蛋白懸液經SDS-PAGE分離后，轉移到固相膜上（如NC、PVDF等），經過非特異結合位點的封閉處理， 進行辣根過氧化酶（HRP）標記的p21單克隆抗體與膜上的蛋白直接和間接（標記二抗）反應，然后加入免疫印跡化學發光試劑，經X光片（放射自顯影片）感光記錄其免疫印跡，用以分析特定蛋白p21表達水平的權威而經典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。其適用于p21 ^{Waf1/Cip1/Sdi1}目標蛋白的免疫學檢測。產品即到即用，性能穩定，操作便捷，敏感度高，顯色清晰，重復性好。

 

技術背景

 

p21蛋白，又稱為p53轉錄因子激發蛋白（WAF1）、細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制物蛋白1A（inhibitor of cyclin-dependent kinase 1A；CDKN1）細胞周期素依賴性蛋白激酶相互作用蛋白1 （cyclin-dependent kinase interacting protein 1； CIP1）、衰老細胞衍生抑制物（senescent cell-derived inhibitor1；sdi1）、細胞周期素依賴性蛋白激酶2/細胞周期素復合物20K相關蛋白（CDK2/cyclin complexes associated 20K protein；CAP20）、黑色素瘤分化相關基因-6（melanocyte differentiation-associated factor 6；MDA-6）等。p21蛋白為21Kd，基因定位于6號染色體上。其至少具有2個功能結構域。氨基末端結構域與細胞周期素依賴性蛋白激酶/細胞周期素復合物相互作用，從而抑制激酶活性和DNA合成，調節細胞生長阻滯，同時在衰老細胞中表達增高。

 

產品內容

 

膠體液（Reagent A） 50毫升

促進液（Reagent B）     100微升

凝結液（Reagent C）  1毫升

聚積液（Reagent D） 25毫升

電泳液（Reagent E）     250毫升

上樣液（Reagent F）     500微升

轉印液（Reagent G）     125毫升

封阻液（Reagent H）     100毫升

清理液（Reagent I）     250毫升

一抗液（Reagent J）     100微升

二抗液（Reagent K）     100微升

發光液A（Reagent L） 50毫升

發光液B（Reagent M） 250微升

產品說明書       1份

 

保存方式

 

保存凝結液（Reagent C）、一抗液（Reagent J）和二抗液（Reagent K）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；發光液A（Reagent D），避免光照，有效保證6月

用戶自備

 

粗提細胞核蛋白（30023）或總蛋白（30002）懸液：待測樣品

低分子量蛋白標準樣：用于定位目標蛋白

無離子水：用于配制工作液

甲醇：用于轉印

1.5毫升離心管：用于蛋白樣品處理的容器

50毫升錐形離心管：用于溶液混勻的容器

500毫升容器瓶：用于配制工作液的容器

塑料盒或塑料袋：用于印跡膜操作的容器

蛋白電泳槽：用于蛋白分離電泳

電轉印儀：用于蛋白印跡轉移

平式震蕩儀：用于孵育和混勻反應

PVDF固相膜：用于電泳后的蛋白轉移的載體

保鮮膜：用于固相膜包裹

X光片：用于發光顯影

 

實驗步驟

 

• 凝膠制備

 

實驗開始前，移取50毫升電泳液（Reagent E）到500毫升容器瓶里，加入450毫升無離子水，混勻后，標記為電泳工作液。然后進行下列操作。

 

• 準備1個50毫升錐形離心管
• 移出10毫升膠體液（Reagent A）
• 加入10微升促進液（Reagent B）
• 再加入100微升凝結液（Reagent C）
• 即刻搖動瓶身，混勻
• 移入準備好的玻璃槽里，預留頂端1至1.5厘米空間，避免氣泡
• 在室溫下，靜置15至45分鐘，直到膠體凝結
• 移出5毫升聚積液（Reagent D）到50毫升錐形離心管里
• 加入5微升促進液（Reagent B）
• 再加入50微升凝結液（Reagent C）
• 即刻搖動瓶身，混勻
• 移入到已有膠體凝結的玻璃槽上端，避免氣泡
• 小心插入10或15孔梳
• 在室溫下，靜置15至45分鐘，直到膠體凝結
• 加入適量的含有電泳液（Reagent E）的電泳工作液到電泳槽里
• 小心取出10或15孔梳
• 用電泳工作液清洗樣品孔

 

二、蛋白電泳

• 從－80℃冰箱里取出待測可溶性總蛋白或核蛋白懸液，置于冰槽里融化（注意：懸液須澄清）
• 移取10微升懸液（蛋白總量為25至50微克）到1.5毫升離心管
• 加入10微升上樣液（Reagent F），混勻
• 煮沸5分鐘
• 小心加入20微升上述樣品到相應的樣品孔里，包括用戶自備的低分子量蛋白標準樣
• 連接電極，打開電源
• 電泳運行3小時或染料峰沿到達距離膠底1厘米處，電壓為150伏

 

• 轉印

• 出25毫升轉印液（Reagent G）到250毫升容量瓶里
• 加入50毫升甲醇
• 加入175毫升無離子水，充分混勻后，標記為轉印工作液，放進4℃冰箱里預冷
• 拆除電泳裝置，取出電泳玻璃板塊
• 分離玻璃板快，切除堆積膠體部分（STACKING GEL）
• 將分離膠體（RESOLVING GEL）浸泡在預冷的100毫升轉印工作液
• 剪下用戶自備的5 cm X 8 cm PVDF轉印膜
• 加入適量的用戶自備的無水甲醇浸濕PVDF轉印膜
• 取出PVDF膜，放進50毫升轉印工作液
• 用剩下的100毫升轉印工作液使過濾紙濕潤
• 組成三明治結構進行濕潤轉印（WET TRANSFER）
• 或在4℃溫度下進行電轉印過夜運行：電壓50伏，電流150-200毫安或運行3至4小時，電壓：50伏，電流為400毫安

 

四、封阻

• 移出20毫升封阻液（Reagent H）到100毫升容量瓶里（注意：使用前，室溫預熱，搖勻封阻液）
• 加入80毫升無離子水，充分混勻后，標記為封阻工作液
• 移出50毫升清理液（Reagent I）到500毫升容量瓶里
• 加入450毫升無離子水，充分混勻后，標記為清理工作液
• 將5 X 8 cm²的PVDF固相膜放進塑料盒里
• 加入75毫升封阻工作液
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育45分鐘
• 小心倒掉封阻工作液
• 加入50毫升清理工作液
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育5分鐘
• 小心倒掉清理工作液
• 重復實驗步驟9至11一次

 

五、結合

• 將固相膜放進塑料袋里或塑料盒里
• 加入10毫升封阻工作液
• 加入20微升一抗液（Reagent J），混勻 
• 將塑料袋封口或蓋上塑料盒
• 確保液體鋪滿整個固相膜表面
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育60分鐘
• 取出固相膜，放進新的塑料盒
• 加入50毫升清理工作液
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育5分鐘
• 移去清理工作液
• 重復實驗步驟8至10三次
• 將固相膜放進新的塑料袋里或塑料盒里
• 加入10毫升封阻工作液
• 加入20微升二抗液（Reagent K），混勻
• 將塑料袋封口或蓋上塑料盒
• 確保液體鋪滿整個固相膜表面
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育60分鐘
• 取出固相膜，放進塑料盒
• 加入50毫升清理工作液
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育5分鐘
• 移去清理工作液
• 重復實驗步驟19至21三次

 

六、顯影

 

實驗開始前，將4℃冰箱里的試劑盒中的發光液A（Reagent L）和發光液B（Reagent M） 置入室溫下，移出10毫升發光液A（Reagent L）到15毫升錐形離心管，加入30微升發光液B（Reagent M），混勻后，標記為發光工作液，用錫箔紙包裹，避免光照。然后進行下列操作。

 

• 加入8至10毫升室溫預熱的發光工作液，鋪滿整個固相膜表面
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育1分鐘
• 用鑷子夾起固相膜，一角放在吸水紙上，吸干發光液
• 用保鮮膜塑料紙包住
• 置于X光片夾，曝光10秒至15分
• 洗印

 

注意事項

 

• 本產品為5次操作（50個樣品）
• 操作時，須戴手套
• 孵育時，避免光照
• 半干式電轉印，運行1小時，電壓為15至20伏
• 轉印工作液建議在4℃冰箱里預冷
• 曝光時間需根據情況調整
• 本公司系列細胞衰老技術試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能長期穩定
• 本產品經鑒定顯影清晰