活體細胞半胱氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）活性原位熒光染色檢測試劑盒

產品說明書（中文版）

主要用途

活體細胞半胱氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）活性原位熒光染色檢測試劑是一種旨在通過半胱氨酸蛋白酶-9抑制劑LEHD-FMK，與熒光染料FITC偶聯作為探針，自由進入細胞內，不可逆地結合活化的半胱氨酸蛋白酶-9，其熒光的增強或減弱說明酶活性的變化，進而分析細胞凋亡的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物細胞的半胱氨酸蛋白酶-9活性檢測。可以被用于細胞凋亡、信號傳遞等的研究。產品嚴格無菌，即到即用，活體檢測，操作簡易，性能穩定。

 

技術背景

 

細胞凋亡是細胞遵循特定程序的自殺，一種進化保留的形式。其程序的主要元素是蛋白水解酶，即半胱氨酸蛋白酶的瀑布式反應：從激發凋亡信號，到酶的裂解活化，最終導致細胞瓦解。半胱氨酸蛋白酶家屬是絲氨酸蛋白水解酶，其活化的酶由2個20Kd的大單體和2個10Kd的小單體組成2個異構二聚體。半胱氨酸蛋白酶家屬分成三大分支：啟動、擴增和執行。受體激活酶的啟動，例如半胱氨酸蛋白酶-8（caspase-8）；啟動性酶或線粒體分子激活擴增反應，例如半胱氨酸蛋白酶-9（caspase-9）；最后上游的酶激活下游的酶執行，例如半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）。半胱氨酸蛋白酶特異性地識別目標底物的4個氨基酸殘基，包括天門冬氨酸。使用熒光標記的特異性底物可以探測半胱氨酸蛋白酶活性。綠色熒光標記的抑制劑，FITC-LEHD- FMK，是亮氨酰-谷氨酰-組氨酰-天冬氨酸（Leu-Glu-His-Asp；LEHD）熒光甲基酮（fluoromethyl ketone；FMK）的異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocynate；FITC）衍生物。該抑制劑進入細胞后，與活化半胱氨酸蛋白酶的大單體上絲氨酸殘基二價共鍵結合，抑制半胱氨酸蛋白酶-9的活性，而未結合的熒光標記彌散出胞外被洗脫。含有熒光標記的細胞進行熒光定性或定量檢測。

 

產品內容

 

染色液（Reagent A）     20微升

稀釋液（Reagent B）      2毫升

清理液（Reagent C）    100毫升

固著液（Reagent D）     10毫升

產品說明書 1份

 

保存方式

 

保存染色液（Reagent A）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；染色液（Reagent A）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細胞脫離

完全細胞培養液（12052）：用于細胞脫落收集

1.5毫升離心管：用于活體細胞染色的容器

（微型）臺式離心機：用于細胞收集的操作

比色皿：用于熒光定量的容器

熒光顯微鏡：用于活體細胞熒光定性分析

熒光分光光度計：用于活體細胞熒光定量分析

細胞流式儀：用于活體細胞熒光分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent B）室溫下預熱。然后移出2微升染色液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管，加入200微升稀釋液（Reagent B），混勻后，在冰槽里靜置，并標記為染色工作液，放在暗室里。然后進行下列操作。

 

• 直接法

 

• 準備1個12孔細胞培養板（內置蓋玻片）的待測細胞，每孔鋪滿率達70％（約30萬細胞數）
• 小心抽去細胞培養液
• 輕輕沿著孔壁加入1毫升 清理液（Reagent C）到細胞培養孔，覆蓋培養孔表面
• 小心抽去 清理液（Reagent C） 
• 加入100微升含有染色液（Reagent A） 和稀釋液（Reagent B）的染色工作液在蓋玻片上
• 室溫下（25℃），孵育20分鐘，注意避光
• 小心抽去100微升染色工作液
• 小心加入1毫升清理液（Reagent C） 
• 小心抽去 清理液（Reagent C）
• 小心加入500微升固著液（Reagent D）
• 室溫下（25℃），孵育30分鐘
• 小心抽去固著液（Reagent D）
• 小心加入1毫升清理液（Reagent C） 
• 小心抽去 清理液（Reagent C）
• 小心加入500微升清理液（Reagent C）
• 即刻在共聚焦或倒置熒光顯微鏡下進行觀察 ：濾波器激發波長490nm，散發波長530nm ――如果綠色熒光強度顯著增強，表明半胱氨酸蛋白酶-9活性增強，細胞凋亡陽性

 

• 間接法

 

• 準備1個12孔細胞培養板的待測細胞，每孔鋪滿率達70％（約30萬細胞數）
• 小心抽去細胞培養液  
• 加入1毫升 清理液（Reagent C）到細胞培養孔，覆蓋培養孔表面
• 小心抽去1毫升 清理液（Reagent C） 
• 加入500微升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養孔表面
• 放進37℃培養箱孵育1分種
• 手擊震動培養板，使細胞脫落
• 加入1毫升用戶自備的完全細胞培養液
• 移入15毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入100微升含有染色液（Reagent A）和稀釋液（Reagent B）的染色工作液
• 用200微升槍頭上下輕柔抽吸，混勻細胞顆粒群
• 轉入到1.5毫升離心管或細胞流式儀專用測試管
• 室溫下（25℃），孵育20分鐘，注意避光
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升清理液（Reagent C），混勻細胞顆粒群
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升固著液（Reagent D），混勻細胞顆粒群
• 室溫下（25℃），孵育30分鐘
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升清理液（Reagent C），混勻細胞顆粒群
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入100微升清理液（Reagent C），混勻細胞顆粒群

 

選擇一、（共聚焦）熒光顯微鏡觀察 

• 混勻后，移出50微升在載玻片上
• 即刻進行載玻片壓片，在熒光顯微鏡下進行觀察 ：濾波器激發波長490nm，散發波長530nm ――如果綠色熒光強度顯著增強，表明半胱氨酸蛋白酶-9活性增強，細胞凋亡陽性

 

選擇二、細胞流式儀分析

• 混勻后，即刻進行細胞流式儀分析：使用FL1，激發波長490nm，散發波長530nm，觀察50000個細胞以上
• 構建柱狀圖/直方圖（Histogram）：log FL1為X軸，細胞數為Y軸――陰性細胞或峰形處于FL1的第一個log位置，陽性細胞處于第一個峰形右側的峰形

 

選擇三、熒光分光光度計測定

• 混勻后，移出100微升到黑色96孔板里或100微升比色皿里
• 即刻進行熒光分光光度儀測定：激發波長490nm，散發波長530nm，獲得相對熒光單位（RFU）――RFU值高表明半胱氨酸蛋白酶-9活性增強，細胞凋亡陽性

 

注意事項

 

• 本產品為20次（0.1毫升工作液）操作
• 所有操作均須無菌狀態下進行
• 操作時，須戴手套
• 待測細胞建議不要過于饑餓或過度生長
• 建議使用正常細胞作為陰性對照，顯示微弱的背景信號
• 建議細胞染色完成后，即刻進行熒光檢測分析，最遲不得超過24小時
• 孵育時，必須避免光照
• 建議使用黑色96孔板進行熒光定量分析
• 本公司提供系列半胱氨酸蛋白酶熒光染色分析試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定熒光清晰