石蠟切片組織細胞色素C免疫熒光檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

石蠟切片組織細胞色素C免疫熒光檢測試劑是一種旨在使用標準化的化學分離石蠟方法和抗細胞色素C單克隆抗體以及熒光染料綴合物二抗的應用，在線粒體特異性熒光染料的幫助下，通過熒光顯微鏡分析存檔中的石蠟包埋的組織切片中細胞區(qū)室（線粒體和細胞漿）的細胞色素C的分布狀態(tài)，從而觀察分析細胞凋亡的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。主要適用于各種動物和人體組織石蠟包埋切片的細胞色素C分析。廣泛用于細胞生物學的研究。產品嚴格無菌，即到即用，反應敏感，操作簡捷，性能穩(wěn)定，熒光清晰。

 

技術背景

 

細胞色素C（CYTOCHROME C）在細胞凋亡中扮演著重要作用。細胞色素C位于線粒體內外膜之間。當細胞凋亡時，它從線粒體內釋放到細胞漿里，引起一系列的信號通道的下游反應。通常使用免疫組化方法，即通過不同波長的熒光染料的重疊染色，檢測其分布，反映細胞凋亡和細胞通路等。 

 

產品內容

 

脫蠟液（Reagent A）             150毫升

補水液A（Reagent B）     50毫升

補水液B（Reagent C）     50毫升

補水液C（Reagent D）     50毫升

補水液D（Reagent E）     50毫升

清理液（Reagent F）         20毫升

修復液（Reagent G）          2毫升

封阻液（Reagent H）          2毫升

抗體液（Reagent I）          1毫升

染色液（Reagent J）          1毫升

重染液（Reagent K）         10微升

抗淬滅液（Reagent L）        500微升

強化液（Reagent M）    100毫升

產品說明書     1份

 

保存方式

 

保存修復液（Reagent G）、封阻液（Reagent H）、抗體液（Reagent I）、染色液（Reagent J）、重染液（Reagent K）和抗淬滅液（Reagent L）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；抗體液（Reagent I）和染色液（Reagent J）嚴禁反復凍融； 染色液（Reagent J）、復染液（Reagent K）和抗淬滅液（Reagent L）避免光照；有效保證6月

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于配制重染工作液的容器

蓋玻片：用于封片孵育

小型染色缸：用于脫蠟的操作

烘箱：用于脫蠟處理

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于組織細胞熒光觀察

 

實驗步驟

 

• 脫蠟處理

 

• 取出10片待測的10微米厚的石蠟包埋的組織切片 
• 放進80℃烘箱，孵育30分鐘
• 室溫下靜置15分鐘
• 按下表依次放進小染色缸里孵育

染色缸	孵育時間
50毫升脫蠟液（Reagent A）	15分鐘
50毫升脫蠟液（Reagent A）	15分鐘
50毫升脫蠟液（Reagent A）	15分鐘
50毫升補水液A（Reagent B）	3分鐘
50毫升補水液B（Reagent C）	3分鐘
50毫升補水液C（Reagent D）	3分鐘
50毫升補水液D（Reagent E）	3分鐘

 

• 小心移去切片上的補水液D（Reagent E）
• 小心加上200微升清理液（Reagent F）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心移去切片上的清理液（Reagent F）

 

二、樣品預處理

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里試劑盒中的試劑置入冰槽里融化。然后進行下列操作：

• （選擇步驟）將切片置于100毫升燒杯，加入50毫升強化液（Reagent M）
• （選擇步驟）放進微波爐里加熱5分鐘：其中15秒煮沸后，間隙15秒后再煮沸，直至5分鐘
• （選擇步驟）室溫下，冷卻20分鐘
• 加入200微升修復液（Reagent G）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心抽去修復液（Reagent G）
• 空氣中晾干
• 加入200微升清理液（Reagent F）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心抽去清理液（Reagent F）
• 加入200微升封阻液（Reagent H）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
• 室溫下孵育60分鐘
• 小心抽去封阻液（Reagent H）

 

• 樣品染色處理

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的重染液（Reagent K）置入冰槽里融化，然后分別移出100微升清理液（Reagent F）和1微升重染液（Reagent K）到新的1.5毫升離心管，標記為重染工作液，并放在暗室里備用。然后進行下列操作。

 

• 加入100微升抗體液（Reagent I）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
• 蓋上蓋玻片，室溫下孵育2至16小時（注意：避免氣泡；參見注意事項8）
• 小心移去蓋玻片，抽去抗體液（Reagent I）
• 加入200微升清理液（Reagent F）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心抽去清理液（Reagent F）
• 重復實驗步4至6二次
• 加入100微升染色液（Reagent J）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
• 室溫下孵育30分鐘，避免光照（注意：避免氣泡）
• 小心抽去染色液（Reagent J）
• 加入200微升清理液（Reagent F）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心抽去清理液（Reagent F）
• 重復實驗步11至13二次
• 加入100微升重染工作液在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
• 室溫下孵育20分鐘，避免光照
• 小心抽去復染工作液
• 加入200微升清理液（Reagent F）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心抽去清理液（Reagent F）
• 重復實驗步18至20二次
• 加入50微升抗淬滅液（Reagent L）
• 蓋上蓋玻片或封片
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下觀察

 

	染色液（Reagent J）	重染液（Reagent K）	合并
熒光染料	異硫氰酸熒光素（FITC）	MitoTracker RED	――
熒光顏色	綠色	紅色	桔黃色
激發(fā)波長	488nm	579nm	――
散發(fā)波長	530nm	599nm	――
作用	細胞色素C顯示	線粒體顯示	線粒體/細胞色素C重疊

 

注意事項

 

• 本產品為10次操作
• 操作時須戴手套，以防污染
• 石蠟包埋前，組織切片須用10％甲醛4℃條件下，固定16小時，否則造成樣品支離破碎
• 所有操作在室溫下進行
• 每次更換試劑溶液時，保持切片面基本晾干。空氣中晾干狀態(tài)為沒有水滴，呈濕潤狀態(tài)，可見反光
• 試劑溶液在切片表面時，避免有氣泡存在，同時確保鋪滿切片表面
• 染色和重染孵育時，須避免光照
• 抗體液（Reagent I）孵育，可以持續(xù)16小時
• 建議染色完成后，即刻進行熒光顯微鏡觀察 
• 本公司提供系列細胞色素C檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩(wěn)定
• 本產品經鑒定熒光清晰