細胞樣品細胞色素C蛋白表達流式細胞儀檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

細胞樣品細胞色素C蛋白表達流式細胞儀檢測試劑是一種旨在使用抗細胞色素C單克隆抗體以及熒光染料綴合物二抗，通過雙重參數細胞流式儀定量檢測樣品中細胞色素C表達水平的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。主要適用于各種活體細胞（動物、人體、植物等）的細胞色素C表達水平的測定。廣泛用于細胞凋亡的研究。產品嚴格無菌，即到即用，反應敏感，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

細胞色素C（CYTOCHROME C）在細胞凋亡中扮演著重要作用。細胞色素C位于線粒體內外膜之間。當細胞凋亡時，它從線粒體內釋放到細胞漿里，引起一系列的信號通道的下游反應。通常使用免疫組化方法定量或定性檢測細胞色素C的蛋白表達水平標記。流式細胞術（FLOW CYTOMETRY）是七十年代發展起來的集計算機、激光、流體力學、細胞化學、細胞免疫學為一體的高科學技術。

產品內容

清理液（Reagent A）    100毫升

固著液（Reagent B）     50毫升

封阻液（Reagent C）     60毫升

抗體液（Reagent D）    700微升

染色液（Reagent E）    600微升

復染液（Reagent F） 5毫升

產品說明書 1份

保存方式

保存固著液（Reagent B）、封阻液（Reagent C）、抗體液（Reagent D）、染色液（Reagent E）和復染液（Reagent F）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；抗體液（Reagent D）和染色液（Reagent E）嚴禁反復凍融；染色液（Reagent E）和復染液（Reagent F），避免光照；有效保證6月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細胞脫離

完全細胞培養液（12052）：用于中和胰蛋白酶的處理

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于細胞染色的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

細胞流式儀：用于細胞熒光分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里試劑盒中的試劑置入冰槽里融化。然后進行下列操作：

• 準備1個6孔細胞培養板的細胞（1 X 10⁶細胞/孔）
• 小心抽去培養液
• 加入2毫升清理液（Reagent A），鋪滿培養孔表面
• 小心抽去清理液（Reagent A）
• 加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液
• 放進37℃細胞培養箱孵育1分鐘
• 加入3毫升用戶自備的完全細胞培養液
• 移取細胞混勻液到15毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為400g（或1500rpm，例如EPPENDORF 5810R）
• 小心抽去上清液
• 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• （選擇步驟）細胞計數
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為400g（或1500rpm，例如EPPENDORF 5810R）
• 小心抽去上清液
• 加入3毫升－20℃預冷的固著液（Reagent B），混勻細胞顆粒群
• 置于冰槽里孵育15分鐘或過夜
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為400g（或1500rpm，例如EPPENDORF 5810R）
• 小心抽去上清液
• 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為400g（或1500rpm，例如EPPENDORF 5810R）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升封阻液（Reagent C），上下抽吸混勻
• 轉移到1.5毫升離心管
• 室溫下孵育30分鐘
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 用手指輕彈管底，使細胞顆粒松動
• 加入70微升抗體液（Reagent D），充分混勻
• 室溫下孵育45分鐘
• 加入1毫升封阻液（Reagent C），混勻
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 重復實驗步驟30至32一次
• 用手指輕彈管底，使細胞顆粒松動
• 加入60微升染色液（Reagent E），充分混勻
• 室溫下孵育45分鐘，避免光照
• 加入1毫升封阻液（Reagent C），混勻
• 渦旋震蕩3秒
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 重復實驗步驟37至40二次
•  加入500微升復染液（Reagent F），用槍頭充分混勻
• 移入到細胞流式儀專用測試管（可放進4℃冰箱里待測），避免光照
• 即刻進行細胞流式儀分析：波長488nm氬離子激光器，觀察50000個細胞以上
• 建立地形圖或散點圖以及直方圖分析

注意事項

• 本產品為10次操作量
• 操作時，須戴手套，以防污染
• 孵育時，避免光照
• 建議細胞染色完成后，即刻進行細胞流式儀分析。如果放進4℃冰箱里待測，不要超過3天
• 細胞流式儀分析前，須混勻內容物
• 細胞檢測量不得少于10000個
• 建議測試陽性或陰性對照組
• 檢測時，須彌補電子補償，以去除雙重參數的光譜重疊
• 告知流式儀技術員有關細胞類型
• 本公司提供系列蛋白表達分析試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定熒光清晰