細胞半胱氨酸蛋白酶-12活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

細胞半胱氨酸蛋白酶-12活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過四肽化合物底物Ac-ATAD-pNA，受到半胱氨酸蛋白酶-12的水解，釋放黃色對硝基苯胺，產生吸光峰值的變化，即采用比色法來測定細胞裂解萃取樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體、植物、昆蟲等）半胱氨酸蛋白酶-12（CASPASE-12）的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

 

技術背景

 

半胱氨酸蛋白酶（Cysteine-requiring Aspartate protease；CASPASE），或稱半胱天冬蛋白酶，是調節細胞凋亡的一類蛋白酶家屬。半胱氨酸蛋白酶-12 （CASPASE-3；EC3.4.22.65）是半胱氨酸蛋白酶家屬中CED-3（Cell Death Gene Number 3；秀麗隱桿線蟲細胞死亡基因數3）分支的一種，與半胱氨酸蛋白酶-1結構相似。半胱氨酸蛋白酶又稱為炎癥半胱氨酸蛋白酶，激活炎癥細胞因子，包括白介素（interleukin）1和18等。半胱氨酸蛋白酶-12分成功能性全長蛋白（full length；Csp12L）和無活性截斷蛋白（inactive truncated form；Csp12S）兩種形式。半胱氨酸蛋白酶-12的活性檢測用來評價細胞或組織炎癥反應的凋亡狀況。基于人工合成的四肽化合物底物Ac-ATAD-pNA（acetyl-Ala-Thr-Ala-Asp-p-Nithoaniline；乙酰丙氨酰蘇氨酰丙氨酰天冬氨酰對硝基苯胺）受到半胱氨酸蛋白酶-12的水解，釋放有色對硝基苯胺，在分光光度儀（405nm 波長）下，測定吸光峰值的變化，來定量測定半胱氨酸蛋白酶-12的活性。半胱氨酸蛋白酶-12反應系統為：

 

CASPASE-12

Ac-ATAD-pNA       →          Ac-ATAD  +   pNA

                                （黃色）

 

產品內容

 

清理液（Reagent A） 120毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

緩沖液（Reagent C）   2毫升

陰性液（Reagent D）     1毫升

底物液（Reagent E）   220微升

產品說明書      1份

 

保存方式

 

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；底物液（Reagent E）避免光照和反復凍融；有效保證6月

 

 

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品制備和儲存的容器

細胞刮脫棒：用于細胞脫離

微型臺式離心機：用于樣品沉淀

培養箱：用于反應物孵育

96孔板或1厘米光徑比色皿：用于樣品比色測定的容器

酶標儀或分光光度儀：用于樣品比色分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的底物液（Reagent E）置入冰槽里融化，避免光照。然后進行下列操作。

 

• 樣品制備

 

• 準備好25cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

 

• 測定準備

 

• 準備好上述制備的（藥物處理的）待測樣品
• 設定好酶標儀（溫度為37℃）：波長405nm，并置零
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

• 活性測定

 

• 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取85微升緩沖液（Reagent C）到相應孔里
• 分別加入5微升陰性液（Reagent D）或上述制備的待測樣品（50微克總蛋白）到相應孔里（注意：樣品須清澈）
• 分別加入10微升底物液（Reagent E）
• 輕輕搖動96孔板（注意：避免氣泡）
• 在37℃溫度下孵育90分鐘（注意：可見反應孔里呈現肉眼可見的黃色）
• 即刻放進酶標儀檢測或轉移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測
• 活性計算：

 

• 酶標儀檢測

 

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.10（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 10.5（毫摩爾吸光系數）X 90 （反應時間；分鐘）X 0.6 （光徑距離；厘米）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾對硝基苯酚/分鐘

 

• 比色皿檢測

 

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.10（毫升，測定容量）]÷[0.005（樣品容量，毫升）X 10.5（毫摩爾吸光系數）X 90 （反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾對硝基苯酚/分鐘

 

注意事項

 

• 本產品為21次（96孔板）操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，且避免反復凍融
• 反應90分鐘后比色測定值通常升高達0.2以上
• 測定值由低到高變化；測定可持續90分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測定90分鐘讀數高于0分鐘讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升；如果樣本酶活性過低，則可以延長反應孵育時間至16小時；其次增加樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 半胱氨酸蛋白酶-12單位活性定義為：在37℃，pH 7.4條件下，每分鐘內能夠切離1微摩爾四肽化合物底物Ac-ATAD-pNA所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列半胱氨酸蛋白酶-12酶學檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感