細菌F型ATP酶（F type ATPase ）活性酶連續反應光度法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

細菌F型ATP酶（F type ATPase ）活性酶連續反應光度法定量檢測試劑是一種旨在使用F型ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續循環法反應系統，在寡霉素參與下，測定與ATP合成對應的ATP水解產生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光度法測定樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種細菌細胞F型ATP酶/ATP合成酶的特異性活性檢測。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，反應優化，檢測敏感。

 

技術背景

 

腺苷三磷酸酶，又稱為ATP酶（adenosine triphosphatase；ATPase或ATP phosphohydrolase；EC3.6.1.3），屬于磷酸水解酶，可以催化含磷的酸酐分解，即催化三磷酸腺苷分解為二磷酸腺苷和無機磷。ATP酶的去磷酸化反應釋放出能量，成為細胞生命代謝的能源。ATP酶為跨膜蛋白（transmembrane），幫助傳輸各種代謝分子進出細胞。根據ATP酶的結構和功能，分為五類不同的ATP酶，即F、V、A、P和E型。P型，又稱為E1E2 型，存在于細菌和真核細胞膜和細胞器上，其功能在于水解ATP獲得能量，跨膜運輸各種化學分子，包括Ca²⁺傳輸性、Na⁺-K⁺ /H⁺-K⁺傳輸性、H⁺傳輸性和所有細菌型等，其中胃氫/鉀ATP酶，一種與胃酸分泌相關的質子泵，屬于這一類型。V型，又稱為V1V0型，主要存在于真核細胞的液泡（vacuole）中。A型，又稱為A1A0型，存在于古生菌（archaea）中。E型，為細胞表面的酶。V型，又稱為V1V0型，也稱為氫V型ATP酶，主要存在于所有真核細胞的囊泡（vacuole或vesicle）中。F型ATP酶（F type ATPase），又稱為ATP合成酶（ATP synthase）、F1F0 ATP酶（F1F0 ATPase）和線粒體呼吸鏈復合物V（complex V），主要在線粒體、葉綠體或細菌細胞膜上，進行氧化磷酸化或光合作用。細菌質膜型F型ATP酶主要有兩個結構域：F0為質子轉運通道，由3個膜蛋白構成，包括a、b、c等；和F1催化活性結構域，由水溶性的α3β3γδε蛋白構成。其最特征性的酶活性是寡霉素敏感的ATP合成酶。細菌F型ATP酶的主要功能通過ATP合成的逆向反應，水解ATP，產生膜內外質子梯度變化，幫助細菌離子轉運和鞭毛運動（flagella motility）。基于ATP，在寡霉素參與下，受到F型ATP酶的水解，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），產生的吸光峰值的變化（340nm），來定量分析F型 ATP酶活性。其反應系統為：

 

F-type ATPase

 ATP   →   ADP  +  Pi

 

pyruvate kinase

Phosphoenolpyruvate  +  ADP       →      pyruvate  +  ATP

         

lactate dehydrogenase

pyruvate  +  NADH       →      lactate  +  NAD⁺

                     （高吸收峰） （低吸收峰）

 

產品內容

 

裂解液（Reagent A）    10毫升

保存液（Reagent B）   5毫升

緩沖液（Reagent C）  20毫升

反應液（Reagent D）      2.5毫升

陰性液（Reagent E）     2毫升

底物液（Reagent F） 500微升

專性液（Reagent G）   250微升

產品說明書      1份

 

保存方式

 

保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；反應液（Reagent D），避免光照，有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

恒溫搖床：用于細菌培養

培養箱：用于反應孵育

比色皿：用于光度分析的容器

分光光度儀：用于光度分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；反應液（Reagent D）注意避光。然后進行下列操作。

 

• 樣品準備

 

• 準備好10毫升待測的細菌放進37℃搖床孵育16小時，速度為220RPM
• 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細胞/毫升
• 置于冰槽里5分鐘
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升裂解液（Reagent A），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里30分鐘，期間強力渦旋震蕩15秒三次
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為300g（或1000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心去掉上清液 
• 加入200微升保存液（Reagent B），混勻
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

 

二、測定準備

 

• 準備好上述待測樣品，置于冰槽里 
• 設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數6次（共5分鐘），并置零
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

• 背景對照測定

 

• 移取780微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升反應液（Reagent D）
• 加入20微升底物液（Reagent F）
• 放進30℃培養箱里靜置3分鐘
• 加入100微升陰性液（Reagent E）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數1分鐘或5分鐘

 

• 樣品總活性測定

 

• 移取780微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升反應液（Reagent D）
• 加入20微升底物液（Reagent F）
• 放進30℃培養箱里靜置3分鐘
• 加入100微升待測樣品（注意：50微克細菌總蛋白；樣品須溶解；參見注意事項4）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數1分鐘或5分鐘

 

• 樣品非特異活性測定

 

實驗開始前，移取100微升待測樣品（注意：50微克細菌總蛋白；樣品須溶解；參見注意事項4）到1.5毫升離心管，加入20微升專性液（Reagent G），混勻后，放進30℃培養箱里孵育15分鐘。然后置于冰槽里備用

 

• 移取760微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升反應液（Reagent D）
• 加入20微升底物液（Reagent F）
• 放進30℃培養箱里孵育3分鐘
• 加入120微升上述預處理的待測樣品
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數1分鐘或5分鐘

 

• 計算樣品活性

 

1）樣品活性（總活性和非特異活性）

 

【（樣品讀數－背景讀數）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數】÷【0.1（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數 X 1或5（反應時間；分鐘）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾NADH/分鐘

 

2）樣品特異活性

 

樣品總活性－樣品非特異活性＝樣品特異活性

 

• 酶標儀測定

 

• 樣品總活性測定

 

• 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品總活性
• 分別移取195微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中
• 分別加入25微升反應液（Reagent D）
• 分別加入5微升底物液（Reagent F）
• 輕輕搖動96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入25微升陰性液（Reagent E）或待測樣品（注意：25微克細菌總蛋白）到相應孔中（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和5分鐘讀數
• 背景對照和樣品總活性實際讀數：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數1分鐘或5分鐘
• 活性計算

 

【（樣品讀數－背景讀數）X 0.25（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數】÷【0.025（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數 X 1或5（反應時間；分鐘）X 0.6（光徑距離；厘米）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾NADH/分鐘

 

• 樣品非特異活性測定

 

實驗開始前，移取25微升待測樣品（注意：25微克細菌總蛋白；樣品須溶解；參見注意事項4）到1.5毫升離心管，加入5微升專性液（Reagent G），混勻后，放進30℃培養箱里孵育15分鐘。然后置于冰槽里備用

 

• 在96孔酶標板上做好相應標記：待測樣品
• 移取190微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中
• 加入25微升反應液（Reagent D）
• 加入5微升底物液（Reagent F）
• 輕輕搖動96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入30微升上述預處理的待測樣品
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和5分鐘讀數
• 樣品非特異活性實際讀數：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數1分鐘或5分鐘
• 活性計算

 

【（樣品讀數－背景讀數）X 0.25（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數】÷【0.025（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數 X 1或5（反應時間；分鐘）X 0.6（光徑距離；厘米）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾NADH/分鐘

 

• 樣品特異活性計算

 

樣品總活性－樣品非特異活性＝樣品特異活性

 

注意事項

 

• 本產品為21次操作（10個樣本），包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品忌用磷酸緩沖溶液 
• 建議使用細菌細胞膜裂解懸液。如果使用細菌細胞裂解懸液，第一須澄清；第二須加50微克
• 加入樣品啟動反應后3秒內即刻光度測定
• 反應測定值由高到低變化；測定可以持續5分鐘
• 測定值由高到低變化，即0分鐘測定讀數高于5分鐘測定讀數，表明有酶活性
• 光度測定后，比色皿須清洗徹底
• 建議待測樣本細菌膜蛋白濃度為20微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調整 （本公司提供 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒30030.1）
• 樣品特異活性是指寡霉素敏感的ATP合成酶
• F型ATP酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列ATP酶類技術產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測準確