細胞血紅素氧合酶（HEME OXYGENASE）活性熒光定量檢測試劑盒

產品說明書（中文版）

 

主要用途

 

細胞血紅素氧合酶（HEME OXYGENASE）活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過NADPH生成系統和血紅素氧合酶-膽綠素還原酶反應系統中，血紅素被水解為膽綠素，還原為膽紅素后其熒光峰值的變化，即采用熒光法來測定樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）或純化微粒體樣品血紅素氧合酶的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

 

技術背景

 

血紅素氧合酶（heme oxygenase；HO；EC1.14.99.3）是一種催化血紅素分解代謝的微粒體內限速酶，即通過氧化降解游離血紅素為一氧化碳、自由鐵和膽綠素（biliverdin）或結合血紅素產物膽綠素蛋白（verdoglobin）。血紅素氧合酶存在于體內的所有細胞中，在脾臟中活性最高，旨在處理衰老的紅細胞。血紅素氧合酶有3種同工酶：I型為誘導型，又歸類為熱休克蛋白32K（heat shock protein 32K），受到氧化應激、一氧化氮、缺氧、重金屬、細胞因子等激發；II型為結構型，維持體內內平衡，在腦組織、睪丸、血管上皮細胞高度表達；III型為結構型，具有氧感受作用，不具有催化活性。其中誘導型血紅素氧合酶（血紅素氧合酶-1；HO-1）是機體最重要的內源性保護物質之一，廣泛參與組織細胞的抗氧化應激損傷，是在細胞受損維持其氧化和抗氧化動態平衡的關鍵因素，成為炎性反應的調節靶標。此外，淤青的形成便是血紅素氧合酶的作用，由紅色的血紅素轉變為綠色的膽綠素，最后變成黃色的膽紅素（bilirubin）。基于底物血紅素（heme），在NADPH生成系統（NADPH generating system）的存在下，由血紅素氧合酶催化分解作用下，產生一氧化碳、自由鐵和膽綠素（biliverdin），進而在膽綠素還原酶（biliverdin reductase）的作用下，產生膽紅素（bilirubin），通過牛血清白蛋白的結合，產生強力熒光（激發波長441nm，散發波長528nm），來定量測定血紅素氧合酶的活性。其反應系統為：

glucose-6-phosphate dehydrogenase

D-glucose-6-phosphate   +   NADP⁺   →   NADPH   +   6-Phospho-D-gluconate

 

heme oxygenase

Heme  + 2 NADPH  +  O₂  →  biliverdin  +  Fe²⁺  +  CO  +  2 NADP⁺   +  H₂O

 

Biliverdin reductase

Biliverdin   +   NADPH  +  H^＋  →  bilirubin   +   NADP⁺   

 

產品內容

 

清理液（Reagent A） 120毫升

裂解液（Reagent B）  70毫升

緩沖液（Reagent C）   5毫升

反應液（Reagent D） 500微升

底物液（Reagent E）   500微升

標準液A（Reagent F1）   1管

標準液B（Reagent F2）   1毫升

產品說明書      1份

 

保存方式

 

保存反應液（Reagent D）、底物液（Reagent E）和標準液（Reagent F）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent E）和標準液（Reagent F）避免光照；有效保證3月

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

細胞刮脫棒：用于細胞脫離

恒溫水槽：用于孵育反應

微型臺式離心機：用于樣品操作

超速離心機：用于樣品操作

渦旋震蕩儀：用于混勻反應

200微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板：用于反應和熒光分析的容器

熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于熒光分析

 

實驗步驟

 

• 樣品準備

 

• 準備好75cm²細胞培養瓶或100mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁷細胞）
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入3毫升預冷的裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約40下）
• 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃超速離心機離心30分鐘，速度為9000g
• 移取上清液到2個新的1.5毫升離心管
• 放進4℃超速離心機離心60分鐘，速度為100000g
• 小心抽去上清液
• 分別加入200微升裂解液（Reagent B）
• 合并到1個1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

 

• 測定準備

 

• 準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取液或微粒體樣品等），置于冰槽里
• 設定好熒光分光光度儀或熒光酶標儀（溫度為37℃）：激發波長441nm，散發波長528nm
• 實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的標準液B（Reagent F2）置入冰槽里融化，然后移出1毫升到標準液A（Reagent F1）管里，混勻后，標記為標準工作液，置于冰槽里備用（注意，用完后即刻放回－20℃冰箱里）
• 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 移取1毫升緩沖液（Reagent C）到1號管
• 分別加入20微升緩沖液（Reagent C）到2至5號管
• 移取2微升上述配制的標準工作液到1號管，混勻
• 小心移取20微升1號管稀釋的標準工作液到2號管，混勻
• 小心移取20微升2號管稀釋的標準工作液到3號管，混勻
• 小心移取20微升3號管稀釋的標準工作液到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

 

管號	緩沖液（Reagent C）	標準工作液	測定體系標準膽紅素濃度
1	1毫升	2微升	100納摩爾/升
2	20微升	20微升1號管	50納摩爾/升
3	20微升	20微升2號管	25納摩爾/升
4	20微升	20微升3號管	12.5納摩爾/升
5	20微升	0	0

 

• 標準曲線測定

 

• 移取150微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入20微升反應液（Reagent D）
• 加入20微升底物液（Reagent E）
• 加入10微升上述配制的標準液
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 即刻放進熒光分光光度儀檢測：獲得相對熒光讀數（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 重復實驗步驟1至7四次
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為相對熒光單位（RFU）；橫座標（X軸）為標準膽紅素濃度（納摩爾/升）

 

• 樣品測定

 

• 移取150微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入20微升反應液（Reagent D）
• 加入20微升底物液（Reagent E）
• 加入10微升待測樣品（20微克微粒體蛋白或100微克細胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 即刻放進熒光分光光度儀檢測：獲得樣品相對熒光讀數（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 根據標準曲線獲得樣品對應膽紅素濃度（納摩爾/升）

 

• 計算樣品實際活性

 

[根據標準曲線獲得樣品對應膽紅素濃度（納摩爾/升） X  0.2 （體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數]÷[0.01 （樣品容量；毫升） X  1（反應時間；小時）]＝皮摩爾/毫升/小時÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝皮摩爾/毫克/小時

 

• 熒光酶標儀測定

 

• 在黑色96孔板上做好相應標記：標準樣品和待測樣品
• 分別移取150微升緩沖液（Reagent C）到相應孔里
• 分別加入20微升反應液（Reagent D）
• 分別加入20微升底物液（Reagent E）
• 分別加入10微升上述配制的標準液或待測樣品（20微克微粒體蛋白或100微克細胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動黑色96孔板
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 即刻放進熒光酶標儀檢測：獲得相對熒光讀數
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為相對熒光單位；橫座標（X軸）為標準膽紅素濃度（納摩爾/升）
• 根據標準曲線獲得樣品對應膽紅素濃度（納摩爾/升）
• 樣品實際活性計算：

 

[根據標準曲線獲得樣品對應膽紅素濃度（納摩爾/升） X  0.2 （體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數]÷[0.01 （樣品容量；毫升） X  1（反應時間；小時）]＝皮摩爾/毫升/小時÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝皮摩爾/毫克/小時

 

注意事項

 

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，標準曲線測定只需1次
• 樣品須澄清，至關重要 
• 孵育反應完成后即刻進行熒光測定
• 如果酶活性過低，可以增加反應時間至2小時
• 熒光測定后，比色皿須清洗徹底
• 可以使用血紅素氧合酶誘導劑硫酸銅（EC50=0.24毫摩爾）作為誘導劑對照或陽性對照
• 建議待測樣本為微粒體，其蛋白濃度為20微克/10微升；待測樣本為細胞裂解懸液，其總蛋白濃度為100微克/10微升（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 通常人體外周血單核細胞血紅素氧合酶活性為：0.2納摩爾/小時/毫克總蛋白
• 血紅素氧合酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.4條件下，每小時內能夠產生1納摩爾膽紅素所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列血紅素氧合酶檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感