組織鳥苷酸酶（GTPase）總活性定磷比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書

（中文版）

主要用途

組織鳥苷酸酶（GTPase）總活性定磷比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)GTP酶反應(yīng)系統(tǒng)中， 測(cè)定GTP水解產(chǎn)生的GDP過(guò)程中，釋放出游離磷酸根，由硫酸亞鐵氨還原產(chǎn)生鉬藍(lán)顯色反應(yīng)后吸光峰值的變化， 即采用比色法測(cè)定樣品酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種動(dòng)物組織（人體和動(dòng)物等）裂解懸液樣品GTP酶的總活性檢測(cè)。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測(cè)敏感。

 

技術(shù)背景

 

鳥苷三磷酸酶，又稱為GTP酶（guanosine triphosphatase；GTPase或GTP phosphohydrolase；EC3.6.5.），屬于鎂離子依賴性磷酸水解酶，可以催化含磷的酸酐分解，即催化三磷酸鳥苷分解為二磷酸鳥苷和無(wú)機(jī)磷。GTP酶在嗅覺(jué)、味覺(jué)和光感覺(jué)信號(hào)通路、蛋白合成、細(xì)胞分化、蛋白質(zhì)的膜轉(zhuǎn)位（translocation）以及囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)等方面具有重要調(diào)控作用。GTP酶受到異源三體G蛋白（heterotrimeric G protein）的調(diào)節(jié)。GTP酶有大型GTP酶和小型GTP酶。其中小型GTP酶（small GTPase），為Ras蛋白同源的單體蛋白家屬，分成5個(gè)亞群：Ras、Rho、Rab、Arf和Ran；其中Rho又細(xì)分為RHOA、RAC1和CDC42。小型GTP酶在各種細(xì)胞信號(hào)通路中起著分子開關(guān)（molecular switch）的作用。基于底物GTP，受到組織細(xì)胞中的GTP酶的水解，釋放出游離磷酸根，由硫酸亞鐵氨還原產(chǎn)生鉬藍(lán)顯色反應(yīng)后，在分光光度儀下（660nm波長(zhǎng)）產(chǎn)生吸光峰值的變化，由此定量分析GTP酶的總活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為： 

 

GTPase

GTP  +  H2O  →    GDP  +  Pi

 

Pi  +  Dye   →    Pi-dye complex

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）  60毫升

裂解液（Reagent B）       10毫升

緩沖液（Reagent C）  25毫升

陰性液（Reagent D）    10毫升

反應(yīng)液（Reagent E）   1毫升

顯色液（Reagent F）  30毫升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）   3毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書      1份

 

 

 

 

保存方式

 

保存裂解液（Reagent B）、緩沖液（Reagent C）、反應(yīng)液（Reagent E）和顯色液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里；顯色液（Reagent F）具有腐蝕性，避免直接用手接觸； 有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品制備和保存的容器

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；顯色液（Reagent F）注意避光。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 樣品準(zhǔn)備

 

• 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入適量的（500毫克組織需要3毫升）清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個(gè)液氮凍存管
• 即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的500微升裂解液（Reagent B） 
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆?/em>）
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 BCA蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30031.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

二、測(cè)定準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好上述待測(cè)樣品，置于冰槽里 
• 設(shè)定好分光光度儀：波長(zhǎng)為660nm，并置零  
• 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管
• 按下表分別加入陰性液（Reagent D）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到每個(gè)離心管，混勻
• 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

 

管號(hào)	陰性液（Reagent D）	標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）	測(cè)定體系標(biāo)準(zhǔn)磷濃度
1	——	500微升	100微摩爾/升
2	100微升	400微升	80微摩爾/升
3	200微升	300微升	60微摩爾/升
4	300微升	200微升	40微摩爾/升
5	500微升	0	0

 

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

 

• 移取500微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液到新的比色皿
• 在37℃溫度下孵育20分鐘
• 加入500微升顯色液（Reagent F），混勻
• 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至5四次
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光單位（A）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)磷濃度（微摩爾/升）

 

• 樣品背景測(cè)定

 

• 移取400微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入50微升待測(cè)樣品（總量100微克組織裂解萃取液蛋白） 
• 在37℃溫度下孵育20分鐘
• 加入500微升顯色液（Reagent F），混勻
• 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品背景對(duì)應(yīng)磷濃度（微摩爾/升）

 

• 樣品活性測(cè)定

 

• 移取400微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入50微升待測(cè)樣品（總量100微克組織裂解萃取液蛋白） 
• 在37℃溫度下孵育2分鐘
• 加入50微升反應(yīng)液（Reagent E）
• 在37℃溫度下孵育20分鐘
• 加入500微升顯色液（Reagent F），混勻
• 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品活性對(duì)應(yīng)磷濃度（微摩爾/升）

 

 

• 計(jì)算樣品活性

 

{[根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品活性對(duì)應(yīng)磷濃度（微摩爾/升）—根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品活性對(duì)應(yīng)磷濃度（微摩爾/升）]X 10（體系倍數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)}÷ 20（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）＝納摩爾磷/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝納摩爾磷/毫克/分鐘

  

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 顯色液（Reagent F）具有腐蝕性，避免直接用手接觸
• 樣品忌用磷酸緩沖溶液 
• 反應(yīng)測(cè)定值由低到高變化
• 如果用戶沒(méi)有660nm波長(zhǎng)，可以使用600至660nm的任一波長(zhǎng)替代
• 吸光讀數(shù)增高，表明具有酶活性
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100微克/50微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高，則可以增加或降低樣本量；注意計(jì)算公式的調(diào)整（本公司提供 BCA蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30031.1）
• GTP酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠產(chǎn)生（釋放）1微摩爾磷所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列ATP酶類技術(shù)產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)準(zhǔn)確

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