重組逆轉錄病毒載體轉染試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

重組逆轉錄病毒載體轉染試劑是一種旨在通過強烈的陽離子脂質體介導載體，幫助重組的目標逆轉錄病毒載體DNA輕易通過單嗜性病毒包裝細胞的權威而經典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。其適用于重組逆轉錄病毒載體DNA（例如莫羅尼氏鼠白血病病毒（MoMuLV）等）轉入單嗜性病毒包裝培養細胞系（例如人胚腎Bosc23細胞等）。可以被用于穩定轉染或暫態轉染。產品嚴格無菌，即到即用，無核酶污染，配比優化，操作簡捷，性能穩定，轉染效率達80至100％。

技術背景

LipofusinX由磷脂形成穩定的微囊，其帶有強負電性的精胺基團，與陰離子DNA形成復合物，與細胞表面帶負電荷的受體結合，通過內吞作用進入細胞，促進極性分子穿透細胞膜，具有超強的穿膜能力。血清干擾因素無損于攜帶外源性DNA高效進入細胞內。逆轉錄病毒是正鏈RNA病毒，其基因組中有編碼反轉錄酶和整合酶（integrase）的基因，在這些酶的作用下病毒基因組RNA被逆轉錄成雙鏈DNA，然后隨機整合在宿主細胞的染色體DNA上，并長期存在于宿主細胞基因組中。

在構建逆轉錄病毒載體時，由于大部分病毒的必需基因和包裝信號被治療基因取代，這樣產生的重組逆轉錄病毒不能表達病毒結構蛋白，因此這種病毒載體已無能力復制和包裝成成熟的病毒顆粒。重組的已插入外源基因的逆轉錄病毒載體必須先在體外一個經過特殊改造和修飾的臨時性細胞（Packaging cell）中復制并包裝，成為含有外源基因的具有感染能力的病毒顆粒。

產品內容

清理液（Reagent A）                   40毫升

轉染液（Reagent B）                  100微升

強化液（Reagent C）                  100微升

產品說明書                                             1份

保存方式

保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

重組質粒DNA：用于轉染的目標DNA

病毒包裝細胞（例如Bosc23細胞）：用于目標DNA轉染的宿主細胞

1.5毫升離心管：用于轉染液和DNA操作的容器

15毫升錐形離心管：用于病毒懸液操作的容器

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細胞脫離

完全細胞培養液（12052）：用于轉染后的細胞培養

實驗步驟

轉染實驗開始前，移取230微升清理液（Reagent A）到無菌的1.5毫升離心管，然后加入10微升轉染液（Reagent B），再加入10微升強化液（Reagent C），用1000微升槍頭輕輕上下抽吸混勻，成為轉染工作液。然后進行下列操作。

• 準備1個25cm²細胞培養瓶（2.7 X 10⁶細胞）的病毒包裝細胞（例如Bosc23細胞等）
• 轉染前24小時，用胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液脫離細胞一次（注意：此步驟重要）
• 重新鋪板到新的25cm²細胞培養瓶（注意：確保細胞完全均勻分離，避免形成細胞團快。此步驟重要）
• 轉染前細胞生長達到80％鋪滿率（注意：此步驟重要）
• 小心抽去細胞培養液
• 加入2毫升37℃預熱的清理液（Reagent A），鋪滿細胞生長表面，等待轉染
• 移取230微升清理液（Reagent A）到無菌的1.5毫升離心管
• 加入20微升用戶需轉染的重組逆轉錄病毒載體DNA（總量3微克），用1000微升槍頭輕輕上下抽吸混勻
• 用1000微升槍頭一滴一滴緩慢加入DNA混勻物到上述配制的轉染工作液里，再用槍頭輕輕上下抽吸混勻
• 混勻后，在室溫下靜置15分鐘，期間輕輕混勻數次
• 小心抽掉細胞培養瓶里的清理液（Reagent A）
• 輕輕加入1毫升清理液（Reagent A）到培養瓶里，鋪滿細胞生長表面
• 輕輕混勻含有DNA的轉染工作液，即刻輕輕緩慢加入所有500微升到細胞培養瓶里
• 輕輕搖動細胞培養瓶，使其混勻
• 放進37℃細胞培養箱，孵育3小時（注意：參見注意事項9）
• 小心抽掉含有轉染液的培養液（注意：參見注意事項10和11）
• 加入5毫升用戶自備的完全細胞培養液
• 放進37℃細胞培養箱，孵育24小時
• 小心抽掉細胞培養液
• 加入2.5毫升用戶自備的完全細胞培養液
• 放進37℃細胞培養箱，繼續孵育24小時（注意：如果細胞生長鋪滿率低于95％，增加培養24小時）
• 移取2.5毫升細胞培養液到15毫升錐形離心管（如果載體攜帶beta－gal報告基因，貼壁細胞可以進行beta－gal染色，確定轉染效率；通常轉染效率達80至100％）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為500g（去除活細胞）
• 或進行針筒過濾器（0.45微米過濾膜）過濾
• 小心移取2.3毫升上清液分裝到2個1.5毫升離心管
• 放進－70℃冰箱里保存
• 或置于冰槽里即刻進行后續感染雙嗜性病毒包裝培養細胞系（例如PA317細胞等）

注意事項

• 本產品為10次操作
• 整個操作須無菌操作
• 操作時，須戴手套
• 注意病毒操作安全
• 操作時使用的槍頭須使用帶濾芯的槍頭
• 建議使用高度純化且無內毒素的載體DNA
• 根據用戶實際情況，建議使用空載體對照或報告基因標記對照
• 建議使用的包裝細胞須經過篩選，例如Bosc23細胞使用霉酚酸篩選，建議使用 Bosc23細胞克隆選擇培養基（12086）
• 孵育時建議將培養瓶密封，以防或避免轉染工作液蒸發
• 更換液體時，須小心，以防細胞松動或脫落
• 如果轉染孵育后，出現較多細胞松動和脫落，直接加入5毫升用戶自備的完全細胞培養液，繼續孵育24小時后，進行更換
• 本產品提供的成分配比優化
• 如果轉染不理想，可以適當調整轉染液、強化液和DNA用量
• 病毒懸液嚴禁凍融超過2次
• 本公司提供系列病毒試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定轉染效率高