細胞果糖-1,6-二磷酸醛縮酶（ALD）活性酶連續循環反應光度法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

細胞果糖-1,6-二磷酸醛縮酶（ALD）活性酶連續循環反應光度法定量檢測試劑是一種旨在通過醛縮酶、磷酸丙糖異構酶和α-甘油磷酸脫氫酶的酶連續反應系統中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光度法來測定細胞裂解樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解懸液樣品（動物、人體、昆蟲等）果糖-1,6-二磷酸醛縮酶的總活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

 

技術背景

 

果糖-1,6-二磷酸醛縮酶（Fructose-bisphosphate aldolase；EC 4.1.2.13），簡稱為醛縮酶（aldolase；ALD），是糖酵解通路中的成員之一，存在于所有動物、植物和大部分微生物中。主要分為兩大類：I類在動物和高等植物中存在，其特征是無需二價金屬輔因子參與；II類在原發細胞（primitive cell）包括酵母和細菌中存在，金屬輔因子必需。動物組織的醛縮酶為同源四聚體，分子量約為160KD，主要有三種異構體：A、B、C型，其催化的反應產物均是看家基因相關性產物。發育胚胎、成年肌肉和紅細胞中產生A型醛縮酶；成年肝臟、腎臟和小腸產生B型醛縮酶；而腦組織、其它神經組織以及平滑肌產生C型醛縮酶。醛縮酶催化果糖-1,6-二磷酸（fructose 1,6-bisphosphate；F-1,6-BP）的可逆性轉化反應，又稱為醇醛縮合反應（aldol reaction），產生3-磷酸甘油醛（glyceraldehyde 3-phosphate；GA3P）和磷酸二羥丙酮（dihydroxyacetone phosphate；DHAP）。A型缺失將導致肌病和溶血性貧血；B型異常將引起遺傳性乳糖不耐受癥（hereditary fructose intolerance）。 基于果糖-1,6-二磷酸在醛縮酶的作用下，產生3-磷酸甘油醛后，通過磷酸丙糖異構酶（triosephosphate isomerase）和α-甘油磷酸脫氫酶（α－glycerol phosphate dehydrogenase）系統，測定還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），產生的吸光峰值的變化（340nm 波長），來定量分析果糖-1,6-二磷酸醛縮酶的總活性。其酶連續循環反應系統為：

 

Fructose-bisphosphate aldolase

fructose-1,6-bisphosphate  +  H2O   →  glyceraldehyde-3-phosphate  +  dihydroxyacetone phosphate

 

triosephosphate isomerase

 glyceraldehyde-3-phosphate   →    dihydroxyacetone phosphate   

 

α-glycerol phosphate dehydrogenase 

2 dihydroxyacetone phosphate  +  2 NADH    →  2 glycerol-3-phosphate  +  2 NAD^＋ 

 

 

產品內容

 

清理液（Reagent A） 120毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

緩沖液（Reagent C）  20毫升

底色液（Reagent D）   2毫升

反應液（Reagent E）     2毫升

陰性液（Reagent F）     1毫升

產品說明書      1份

 

保存方式

 

保存裂解液（Reagent B）、緩沖液（Reagent C）、底色液（Reagent D）和反應液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底色液（Reagent D）和反應液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細胞刮脫棒：用于細胞脫離

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

比色皿或96孔板：用于光度分析的容器

分光光度儀或酶標儀：用于光度分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

 

• 樣品準備

 

• 準備好25cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

• 測定準備

 

• 開啟并設定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長340nm，間隔60秒，讀數6次（共5分鐘），并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底色液（Reagent D）避免光照
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

• 背景對照測定

 

• 移取780微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升底色液（Reagent D）
• 加入100微升反應液（Reagent E）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升陰性液（Reagent F）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（0分鐘讀數－5分鐘讀數）

 

• 樣品測定

 

• 移取780微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升底色液（Reagent D）
• 加入100微升反應液（Reagent E）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升待測樣品（20微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（0分鐘讀數－5分鐘讀數） 

 

五、計算樣品活性

 

[（樣品讀數－背景讀數）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數]÷[0.02（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數）X 5（反應時間；分鐘）X 2]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾果糖-1,6-二磷酸/分鐘

 

• 酶標儀測定

 

• 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取195微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中的所有孔里
• 分別加入25微升底色液（Reagent D）
• 分別加入25微升反應液（Reagent E）
• 輕輕搖動96孔板
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入5微升陰性液（Reagent F）或待測樣品（20微克蛋白）到相應孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和5分鐘讀數
• 活性計算

 

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數）X 0.6（光徑距離；厘米）X 5（反應時間；分鐘）X 2]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克 

 

單位＝微摩爾果糖-1,6-二磷酸/分鐘

 

注意事項

 

• 本產品為20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 建議使用比色皿測定
• 樣品須澄清，至關重要 
• 加樣后3秒內光度測定
• 測定值由高到低變化；測定可持續5分鐘
• 光度測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測定0分鐘讀數高于5分鐘讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為20微克/20微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 果糖-1,6-二磷酸醛縮酶單位活性定義為：在25℃，pH 7.4條件下，每分鐘內能夠切離1微摩爾果糖－6－磷酸所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列細胞酶學檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感