ATCC 17556 熒光假單胞菌的作用機制與應用！
 
一、背景
 
熒光假單胞菌屬薄壁菌門假單胞菌科假單胞菌屬，屬于rRNAI群熒光假單胞菌DNA同源組。熒光假單胞菌DNA同源群包括熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌，是一種革蘭陽性桿菌，以不產綠膿素而產熒光素而得名。為環境污染菌。對人類是少見機會病原菌，可從傷口、痰、胸水、尿和血液中分離出，亦可從血庫血中分離。可在冰箱儲存的血液及血液制品中繁殖，而且自溶后釋放內毒素。
 
其內毒素的磷脂體部分，可導致不可逆的休克。依據菌落形態、色素、生理生化和營養的特性等表型特征將熒光假單胞菌分為5個生物型：I、II、III、IV、G。最早對熒光假單胞菌生防作用的研究是在1978年發現處理馬鈴薯種塊能增加產量。19世紀70年代首次提出熒光假單胞菌產生的噬鐵素促進植物生長并抑制植物病害，1986年首次報道克隆得到菌株的抗生素基因。
 
熒光假單胞菌能夠產生10多種抗生性次級代謝產物，在生物防治和生防菌劑的開發及應用方面有巨大的潛力。近年來，隨著分子生物學的廣泛滲入，通過對這些作用機制的遺傳性狀進行分析，采用遺傳工程加以改良，使得熒光假單胞菌具有更誘人的生防效果。但是，隨著對熒光假單胞菌的深入研究，一些學者發現熒光假單胞菌也存在一定的危害培養特征。
 
二、培養特征
 
熒光假單胞菌是典型的革蘭氏陰性菌，電鏡觀察其菌體呈桿狀，對數生長期時大小一般為（0.7～0.8）μm×（2.3～2.8）μm，呈單個或成對排列，具有極生鞭毛，偶見無鞭毛無動力的菌株，運動活潑，不形成芽孢。DNA的G+C比例范圍為59.4～61.3克分子％，生物型IV有最低值，生物型II有最高值。該菌能液化明膠，葡萄糖發酵、蔗糖發酵、乳糖發酵均為陽性，并且能以多種醇類物質作為碳源，不能利用乙醇、L－鼠李糖等。甲基紅試驗、檸檬酸鹽發酵、接觸酶反應均為陽性，水解淀粉、脂酶反應陰性，對青霉素有抗性，不產生綠膿菌素。
 
具有分解纖維素、蛋白質和結合Fe3+ 的能力，但不能分解幾丁質。有些菌株（生物型II，III和IV）能進行反硝化，生物型I和III在卵黃反應中為陽性，生物型I一般可分解脂肪，生物型II不解脂。營專性好氧生活，可在pH5.7和7％ NaCl的環境中生長，最適生長溫度約25～30℃。大多數菌株在4℃或4℃以下生長，在41℃不生長。
 
熒光假單胞菌在KMB固體培養基上于28℃下培養2d后，生長良好，菌落微隆起，磚紅色，邊緣呈波浪花紋向外擴展，表面較濕潤稍凸起不透明，易用接種針挑起，與該菌屬下其他種類的典型區別在于能產生水溶性的黃綠色素（青膿素），紫外線（366nm）斜光照射下可見黃綠色熒光。熒光假單胞菌在普通培養基、麥康凱、沙門和志賀菌屬瓊脂培養基平板上均可生長。在PDA培養基上長勢極弱或不生長，菌落深紅色。
 
微生物的良好生長需要培養基各組分濃度和比例合適，碳源和氮源對菌體的生長或蛋白的表達影響較大，濃度太低會造成營養缺乏，限制菌體正常生長，進而影響代謝產物的產量。國內外一些學者對熒光假單胞菌的最佳生長條件做了研究，對一些促生菌和生防菌的最適培養條件進行了測定和分析，為菌株的最佳發酵條件和生態適應性評價提供了依據。
 
三、作用機制及應用
 
熒光假單胞菌是一種重要的植物病害生防菌和根際促生菌（PGPR），具有繁殖速度快、適應能力強、易于人工培養、制劑穩定、施用方便、不污染環境、防治多種植物病害等優點。研究表明，熒光假單胞菌抑制病原菌的菌絲生長、游動孢子囊的產生和游動孢子的萌發，在顯微鏡下觀察發現生防菌使病原菌菌絲發生畸形。
 
生防菌的抑菌圈直徑大，抑菌率高。通過降低病害的發病程度，能夠提高植物種子的發芽率和活力指數，從而保證農作物的正常生長。生防菌能在根部定殖，也能通過葉面噴施來防治病害。有學者不僅在室內進行了拮抗性研究，還在田間測試了熒光假單胞菌的防治效果，結果發現拮抗效果都非常明顯。該菌的生防機制包括：抗生素作用、噬鐵素對鐵的營養競爭、有效的根際定殖、次生抗性代謝物和誘導植物系統抗性等。
 
1. 抗生素介導的抑制
熒光假單胞菌可通過產生多種抗生素對植物病害的病原物產生抑制。產生抗生素是生防菌抵抗病原菌的重要機制。細菌通過系統抗性的誘導或者通過抗微生物化合物的合成保護植物。熒光假單胞菌產生的抗生素有1－羧基吩嗪（PCA）、2，4－二乙酰藤黃酚（DAPG）、藤黃綠膿菌素（Plt）、吡咯菌素（Prn）、綠膿菌素（PyOCyAnin）、卵菌素A（OOmyCinA）等。
 
PCA為吩嗪類物質，在細胞內作為電子載體傳遞電子到靶細胞，增加胞內超氧化物自由基，使靶細胞中毒死亡；DAPG和Plt為聚酮類抗生素，具有廣譜抗菌活性；Prn屬于氨基糖甘類抗生素，在低濃度時破壞氧化磷酸化的偶聯機制，而在高濃度時阻止參與呼吸作用的黃素蛋白和細胞色素C的電子運輸。許多學者認為熒光假單胞菌產生的DAPG是拮抗根部病害的關鍵因素，DAPG充當誘導其本身的生物合成基因的表達信號的化合物。這些抗生素通常在很低濃度下就可阻礙病原微生物的生長。
 
2. 噬鐵素介導的抑制
熒光噬鐵素是由熒光假單胞菌產生的胞外水溶性黃綠色素，是其特有的鐵載體，可以螯合環境中微量的鐵元素。其作用機制是通過配合基的螯合反應，形成鐵－噬鐵素螯合物，從而增加土壤中的生物有效性，并通過特異的轉動系統將鐵轉移到體內，不僅可以滿足自身的生長需要，還可以使環境中的鐵濃度進一步降低，抑制病原微生物的生長繁殖，進而達到控制植物病害的目的。
 
3. 根部定殖
熒光假單胞菌只有成功地在根際定殖后，其抑制機制才能真正起作用。熒光假單胞菌能在幼根表面形成一層均勻的保護層；而沒有防病作用的菌株不產生保護層，說明熒光假單胞菌在根部定殖時保護了病原菌的侵染位點，降低侵染機會，是防病的關鍵因素之一。不同的熒光假單胞菌在不同的根際有不同的定殖能力。定殖能力的強弱也與土壤類型相關的間接因素如濕度、溫度、PＨ 值等有關。
 
4. 次生抗性代謝物
熒光假單胞菌產生許多具有抗性的次生代謝物，對植物病原菌具有拮抗作用。如一些熒光假單胞菌產生的HCN能影響植物的病原菌。熒光假單胞菌還能產生幾丁質酶、溶菌酶、木聚糖酶和胞外殼聚糖酶等對物質進行降解，在給植物提供營養的同時還可減少植物病害的發生。
 
5. 誘導植物系統抗性
某些植物如煙草、黃瓜、擬南芥等對病毒、細菌和真菌葉部病原的誘導抗性可能是由于一些熒光假單胞菌在根部的定殖而產生。其可能的作用機制是產生抗微生物的低分子量化學物質，如植物保護素、雙萜、多聚物、木質素和糖蛋白，誘導一些水解酶和氧化酶類。水楊酸、脂多糖、噬鐵素是重要的誘導物質。植物種類、植物病害以及植物生長環境的不同，熒光假單胞菌抑制病原菌的機理有所不同。
 
研究表明，熒光假單胞菌產生的抗生素可以改變病原菌細胞的通透性，降低細胞的表面張力，從而使細胞破裂死亡。研究表明，熒光假單胞菌產生的噬鐵素螯合了鐵元素，降低了環境中的鐵元素的濃度，從而讓病原菌不能很好地生長，達到抑制病害的目的。
 
目前，國內外學者通過基因手段檢測次生代謝產物對植物病害防治的研究較多。許多學者通過基因手段，將合成次生代謝產物的基因突變，發現不產生次生代謝產物的缺失突變株無防病功能或防病能力明顯下降，純化后的次生代謝產物通過誘導局部和系統抗病性而發揮防病作用。研究了如何利用GACA/GACS系統檢測遺傳穩定性好的優良菌株VUPf5產生次生代謝產物防止小麥上的病害。通過對VUPf5的GACA基因和GACS基因進行突變，然后與具野生型基因的菌株對比，發現生產次生代謝產物的效率顯著降低。
 
四、風險
 
熒光假單胞菌除了可以防治植物的病害之外，本身還是一種環境污染菌。在日常生活中，熒光假單胞菌是奶類、蛋類在低溫保存條件下導致腐敗變質的主要細菌之一。熒光假單胞菌對于人類是一種罕見的機會致病菌。在臨床上最多見的是血液及血制品被熒光假單胞菌污染，當病人輸入了被熒光假單胞菌污染的血液及血制品后，可出現敗血癥、感染性休克和血管內凝血等嚴重后果。
 
由于現有的許多抗生素對熒光假單胞菌都不敏感，所以一旦感染此菌，病死率很高。熒光假單胞菌還可以使一些動物體發生病變，產生相應的癥狀。在植物體中，熒光假單胞菌可以協同一些病蟲害加重對植物體的危害，如研究發現，松材線蟲在結合有毒的熒光假單胞菌時，能夠促進黑松的致病率。熒光假單胞菌對動植物的危害受到外部環境的影響，越有利于熒光假單胞菌生長的環境就對動植物的危害越大。
 
隨著接種冰核細菌的濃度增加，煙株的凍害程度逐漸加劇。假單胞菌屬中除了熒光假單胞菌之外，其他的假單胞菌也能造成環境的污染。研究發現寧波沿海陸源排污口中存在較多的假單胞菌屬，假單胞菌屬的含量與排污口的主要污染物有關，氨氮含量較高的排污口假單胞菌屬的含量更高。還推測與季節性溫度變化有關。
 
五、分離篩選
 
目前，通常采用平板稀釋法分離篩選熒光假單胞菌。分離篩選的指標包括熒光假單胞菌的體外病原體抑制、生物表面活性劑的生產、磷酸鹽的溶解能力和參與抗生素合成的基因等方面，從而得到生防能力較強的菌株。對分離篩選得到的菌株經過形態、生理生化試驗以及16ＳrRNA基因序列分析，參考《伯杰細菌鑒定手冊》就可鑒定此類生防菌為熒光假單胞菌。近些年，研究者從不同植物根際對熒光假單胞菌進行了分離篩選，獲得了一些有應用潛力的菌株：
 
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