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急性髓系白血病培養基是一種為促進人源急性髓系白血病原代細胞體外生長而設計的完全培養基。它是一種無菌的液體混合系統,含有必需和非必需的氨基酸、維生素、有機和無機化合物、生長因子、微量礦物質等。培養基基于碳酸氫鹽的緩沖體系,在5% CO2、37℃空氣的培養箱中平衡時,pH值為7.4。該培養基的配方(定量和定性),可以提供一個合適的平衡的體外培養環境,選擇性地促進人源急性髓系白血病原代細胞的生長。
1. 樣品分離
(1) 使用移液器將抗凝管中的外周血或骨髓樣本混勻,轉移至15 mL無菌離心管中,1500 rpm 離心5 min;
(2) 棄血漿,向血細胞沉淀中加入3~5倍1 x PBS稀釋至9 mL,充分混勻;
(3) 另取15 mL離心管,加入6 mL人外周血淋巴細胞分離液,傾斜緩慢地加入上述稀釋的血細胞沉淀,與分離液明顯分層,設置轉速400 g、升速2、降速0、溫度25 ℃,離心30 min;
(4) 離心后,離心管中由上至下細胞分四層(PBS層、環狀乳白色細胞層、分離液層、紅細胞層),移液器環形吸取白細胞層至預先加入5 mL 1 x PBS的15 mL離心管中,輕輕混勻洗滌細胞,1500 rpm室溫離心3 min;
(5) 棄上清,加入6 mL 紅細胞裂解液重懸細胞沉淀,4 ℃裂解15~20 min,中間顛倒混勻一次,1500 rpm室溫離心3 min;
(6) 棄上清,加入1~5 mL完全培養基重懸細胞沉淀,活細胞計數后(細胞活率至少>50%),接種活細胞于培養瓶/板,置37 ℃、5%二氧化碳培養箱中培養。
2. 細胞傳代
(1) 鏡下觀察細胞形態,待懸浮細胞長滿至 80%~90% 時即可傳代;
(2) 將細胞懸液轉移至15 mL離心管,1500 rpm室溫離心3 min;
(3) 棄上清,以1~2 mL培養基重懸細胞,活細胞計數,接種活細胞于培養瓶/板,置37 ℃、5%二氧化碳培養箱中培養。