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腸癌條件重編程培養基是一種為促進人源腸癌原代細胞體外生長而開發的培養基。它是一種無菌的液體混合系統,含有必需和非必需的氨基酸、維生素、有機和無機化合物、激素、生長因子、微量礦物質和一定量的血清。培養基基于碳酸氫鹽的緩沖體系,在5% 、37℃培養箱中平衡時,pH值為7.4。該培養基的配方可以提供合適的人源腸癌原代細胞體外培養環境,選擇性地促進體外人源腸癌原代細胞的生長。
1. 腸癌原代細胞培養
獲取的人源腸癌原代細胞,按照說明書表1中細胞數接種在合適的培養器皿中,加入γ射線輻照后的NIH-3T3細胞(γ-NIH-3T3作為滋養層細胞,添加滋養細胞數量詳見說明書),原代細胞初次接種后2-3 天勿動(利于細胞貼壁),培養過程中若培養基顏色變黃但細胞未長滿時可進行半換液,鏡下觀察細胞未長滿但γ-NIH-3T3細胞已不足時,適量補充γ-NIH-3T3細胞(一般補加初始數目的一半)。
2. 腸癌原代細胞傳代
鏡下觀察細胞形成克隆,且匯合度85~95%時即可傳代;培養箱中取出細胞,棄舊培養液,0.05%胰酶洗滌5秒后吸盡,再加入適量0.05%胰酶,37℃孵育,2~5 min后拿出輕拍培養瓶/板側面,顯微鏡下觀察細胞消化情況;細胞消化至細胞變圓并開始脫落時用原代細胞終止培養基終止消化,并將細胞轉移至離心管中,1500 rpm,3 min;棄上清,以1~5 mL相對應的原代細胞培養基重懸細胞,活細胞計數,將細胞懸液按適合的細胞密度接種于培養瓶/板,加入γ-NIH-3T3細胞(不同規格培養瓶/板底面積、接種原代細胞數量、添加滋養細胞數量詳見說明書),補加腸癌培養基至所需體積,十字交叉混勻,培養容器75%表面消毒后置培養箱,37 ℃ 、5 % CO2條件培養。其他步驟同上。