教學實驗室醫學真菌的鑒定與保藏方法！

醫學真菌作為自然界重要的生物資源，已成為微生物學實驗中不可或缺的基本材料，應用頻率較高。這其中部分為病原性真菌，而如何有效地保存保管好真菌菌種，以何種方式長期穩定地保持其生物遺傳特性，則成為我們日常工作中需要研究探討的問題。

一、材料與方法

1、教學實驗室保存的菌種     
⑴單細胞真菌：白色念珠菌、新生隱球菌。
⑵多細胞真菌：黑曲霉菌、青霉菌、木霉菌。

2、醫學真菌菌種的鑒定     
菌種使用前，均需進行形態學、生化學方面的鑒定，合格后方可使用。具體鑒定方法：(1)單細胞真菌：碳源發酵試驗、產子囊孢子及芽管試驗、咖啡酸試驗、尿素酶試驗；單細胞與多細胞真菌鑒定共用實驗：玉米粉吐溫80瓊脂小培養顯微鏡下觀察。(2)多細胞真菌：蛋白水解試驗、37℃生長試驗、溫度試驗、PDA小培養實驗。

3、真菌菌種的保藏方法     
由于教學實驗各時期使用的真菌菌種在數量及種類上不盡相同，所以與其相適應的培養方法與保管方式亦不相同。大體上分為定期傳代保存法、超低溫凍結保存法兩種。

⑴定期傳代保存法     
①液體培養基保存法：單細胞真菌接種于RPMI 1640培養基中,37℃培養24 h，取出后置4℃冰箱保存。該方法用于學期初低溫凍結菌種的復蘇、增菌培養。
②瓊脂平板培養基保存法：學期開始，多細胞凍結菌種解凍后，劃線接種于察氏平板培養基上面，28℃培養7～8  d，再將培養菌絡移種于改良馬丁平板培養基上，28℃培養7 d，待培養菌絡生長良好,置4℃冰箱保存。為多細胞真菌的復蘇與鑒定試驗。
③瓊脂斜面培養基保存法：單細胞真菌由液體培養基中多細胞真菌從馬丁培養基表面，分別挑取菌種菌絡，蜿蜒化線接種于各自相對應的瓊脂斜面培養基中,經37℃或28℃培養生長良好后，置4℃冰箱保存備用。該方法用于學期中，真菌菌種即將使用，實驗課前的菌種純化和制備階段。
④液體石蠟覆蓋保存法：將無菌液體石蠟油覆蓋于菌絡生長良好的瓊脂斜面真菌培養物表面，厚度約1 cm左右，置4℃冰箱保存。該法用于學期末對真菌菌種較長時期的保存方法。

⑵液氮超低溫凍結保存法     
將單細胞或多細胞真菌培養物,以無菌生理鹽水洗下并計數，加入等量脫脂牛奶保護劑，分裝進安瓿后封口。選擇菌種不同的適宜冷卻速度，使瓿內菌懸液急速或慢速凍結成冰。置液氮超低溫下保存。
 
二、結果
      
1、定期傳代保存法     
⑴液體培養基保存法，可保存單細胞真菌15 d左右。
⑵瓊脂平板培養基保存法，保存多細胞真菌15 d。
⑶瓊脂斜面培養基保存法，保存單細胞、多細胞真菌1個月。
⑷液體石蠟覆蓋保存法，可保存真菌菌種6個月。

2、液氮超低溫凍結保存法     
可保存凍結菌種1年。

三、小結
        
一般認為，傳代移種保存法保存的菌種，易失去病原性，而超低溫保存法能夠完整的保存菌種的致病性。為此，我們針對實驗的初、中、末3個時期，對菌種的保存選擇不同的保存方法，優化了菌種的遺傳特性不變性。
            
實驗顯示，反復的移種傳代會使菌種的致病力和生理活性下降，孢子形成能力減弱，故超低溫凍結保存菌種，是最佳保藏菌種的方法，唯一不足的是菌種復蘇啟動時間較長。

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