當(dāng)前位置 > 技術(shù)服務(wù) > 生物研發(fā)服務(wù)> 測序/合成 > 10x Visium CytAssist 空間轉(zhuǎn)錄組測序
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從新鮮樣本到FFPE樣本，空間轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)把可用有意義的臨床樣本更大程度地利用到疾病的研究中。
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從新鮮樣本到FFPE樣本，空間轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)把可用有意義的臨床樣本更大程度地利用到疾病的研究中。然而，在實際的實驗過程中，新鮮包埋樣本或者FFPE樣本的一些本身問題和技術(shù)平臺的限制，導(dǎo)致我們理想中的空間轉(zhuǎn)錄組測序并不是一帆風(fēng)順。
之前的Visium新鮮樣本實驗需要對術(shù)后的樣本進行及時冰凍包埋，且組織截面積大小不能超過6.5*6.5mm的芯片規(guī)格，對冰凍樣本的RNA質(zhì)檢結(jié)果需要達到RIN值7以上。同時，該實驗需要一次性同時做4個矩陣，即需滿足4個樣本切片，樣本質(zhì)檢的透化預(yù)實驗時間還需比較接近。
之前的Visium FFPE實驗需要將石蠟樣本進行切片，貼片到Visium芯片并經(jīng)過質(zhì)檢及粘附性測試后，才能進行后續(xù)實驗，對樣本質(zhì)量要求較高。在實驗中經(jīng)常會面臨以下問題：（1）無法轉(zhuǎn)移已經(jīng)貼片到普通玻片的稀有樣品；（2）無法只針對感興趣的區(qū)域進行分析；（3）6.5*6.5mm的芯片規(guī)格無法一次性對大面積的組織進行分析；（4）石蠟樣本保存時間過長，質(zhì)檢不合格或切片過少，不滿足粘附性測試；（5）石蠟樣本不允許帶出醫(yī)院等。
針對上述問題，10x Genomics推出了全新的Visium CytAssist空間轉(zhuǎn)錄組，能夠直接將新鮮冰凍樣本、FFPE組織切片上的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)分析物從標(biāo)準(zhǔn)的組織學(xué)載玻片轉(zhuǎn)移到Visium玻片上，無需進行多次切片貼片及粘附性測試實驗，極大的簡化了樣本的處理。
產(chǎn)品特點
● 兼容樣本類型更豐富：適用于新鮮樣本、普通石蠟塊組織、存檔的玻片樣本、已經(jīng)通過H&E染色或者免疫熒光染色貼在普通玻片上的樣本等；
● 簡化樣本處理：直接將轉(zhuǎn)錄組分析物從標(biāo)準(zhǔn)載玻片轉(zhuǎn)移到Visium玻片的捕獲區(qū)域；
● 樣本質(zhì)量要求降低：DV200 > 30% 即可進行后續(xù)實驗；
● 高靈敏度：獨特的RTL探針設(shè)計，每個基因設(shè)置1~3對捕獲探針，高特異性、高靈敏地捕獲所有基因；
● 芯片配置更靈活：兼具 6.5*6.5 mm和 11*11 mm兩種規(guī)格，較大組織也可一次性完成檢測，適用于更多組織類型；
● 獲得更多的空間見解：通過標(biāo)準(zhǔn)的組織學(xué)技術(shù)預(yù)先篩選組織切片，選擇出最有生物學(xué)意義的切片；
● 縮短實驗周期：使用CytAssist專用玻片和試劑，每次運行可從最多兩張FFPE組織切片中精確捕獲分析物，而時間不到一小時；
● 多組學(xué)分析：提供商業(yè)化的35種蛋白組合試劑盒，可以對同一FFPE樣本進行轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)的同時分析，對基因表達檢測的同時檢測幾十種蛋白。
CytAssist空間轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒灹鞒碳安东@芯片設(shè)計
在VisiumﾠCytAssist流程中，切片、脫蠟以及染色和成像（H&E或IF）的步驟是在標(biāo)準(zhǔn)載玻片上進行的。在探針雜交后，將兩張標(biāo)準(zhǔn)載玻片和一張含兩個捕獲區(qū)域的Visium玻片放入CytA ssist儀器中，讓標(biāo)準(zhǔn)載玻片上的組織切片與兩個Visium捕獲區(qū)域的頂部對齊，并通過 Visium CytAssist 儀器捕捉明場圖像，確定感興趣的病理區(qū)域；接著，運行VisiumCytAssist 儀器將普通玻片組織切片上選定目標(biāo)區(qū)域的探針原位轉(zhuǎn)移到 Visium 捕獲區(qū)，Visium 捕獲區(qū)域通過帶有不同位置標(biāo)簽的探針捕獲轉(zhuǎn)錄組信息（探針釋放和捕獲），從而獲取石蠟切片不同空間位置的轉(zhuǎn)錄表達水平。其余步驟（從探針延伸開始）按照Visium FFPE標(biāo)準(zhǔn)流程在儀器外進行。
CytAssist空間轉(zhuǎn)錄組設(shè)計了兩種規(guī)格的捕獲芯片，分別為大小為6.5*6.5mm以及11*11mm的捕獲點陣。每個點陣上包含有55μm直徑，間距100μm的攜帶空間Barcodes和UMI，Poly(dT)的探針群。每張芯片可同時進行2張組織切片的檢測。
CytAssist空間轉(zhuǎn)錄組測序捕獲芯片設(shè)計
常規(guī) Visium vs CytAssist
研究領(lǐng)域
空間轉(zhuǎn)錄組一站式解決方案
空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析流程
● BayesSpace：增加空間分辨率
BayesSpace，一種完全貝葉斯統(tǒng)計方法，通過使用來自空間鄰域的信息來增強空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分辨率并進行聚類分析，能夠有效識別具有相似表達譜的空間簇以及提高空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分辨率。
● CellTrek：根據(jù)scRNA-seq和ST數(shù)據(jù)直接將單個細胞映射到組織切片的空間坐標(biāo)SPOTlight：
● Cell2location：將單個細胞參考細胞類型映射到空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集
● SPOTlight：識別每個spot中的細胞類型和比例
實驗設(shè)計
案例分析（二）
實驗設(shè)計
對于FFPE樣本，請在制備和保存FFPE樣本過程中，盡可能減少因固定包埋操作而引起RNA/DNA/蛋白質(zhì)量下降。目前Visium for FFPE 檢測，對組織的固定包埋方法不做限制。在最后石蠟包埋步驟，建議使用組織包埋盒（圖示），在包埋過程中承載組織樣本，以便進行包埋、組織切片和安全存放。
之前的Visium新鮮樣本實驗需要對術(shù)后的樣本進行及時冰凍包埋，且組織截面積大小不能超過6.5*6.5mm的芯片規(guī)格，對冰凍樣本的RNA質(zhì)檢結(jié)果需要達到RIN值7以上。同時，該實驗需要一次性同時做4個矩陣，即需滿足4個樣本切片，樣本質(zhì)檢的透化預(yù)實驗時間還需比較接近。
之前的Visium FFPE實驗需要將石蠟樣本進行切片，貼片到Visium芯片并經(jīng)過質(zhì)檢及粘附性測試后，才能進行后續(xù)實驗，對樣本質(zhì)量要求較高。在實驗中經(jīng)常會面臨以下問題：（1）無法轉(zhuǎn)移已經(jīng)貼片到普通玻片的稀有樣品；（2）無法只針對感興趣的區(qū)域進行分析；（3）6.5*6.5mm的芯片規(guī)格無法一次性對大面積的組織進行分析；（4）石蠟樣本保存時間過長，質(zhì)檢不合格或切片過少，不滿足粘附性測試；（5）石蠟樣本不允許帶出醫(yī)院等。
針對上述問題，10x Genomics推出了全新的Visium CytAssist空間轉(zhuǎn)錄組，能夠直接將新鮮冰凍樣本、FFPE組織切片上的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)分析物從標(biāo)準(zhǔn)的組織學(xué)載玻片轉(zhuǎn)移到Visium玻片上，無需進行多次切片貼片及粘附性測試實驗，極大的簡化了樣本的處理。
產(chǎn)品特點
● 兼容樣本類型更豐富：適用于新鮮樣本、普通石蠟塊組織、存檔的玻片樣本、已經(jīng)通過H&E染色或者免疫熒光染色貼在普通玻片上的樣本等；
● 簡化樣本處理：直接將轉(zhuǎn)錄組分析物從標(biāo)準(zhǔn)載玻片轉(zhuǎn)移到Visium玻片的捕獲區(qū)域；
● 樣本質(zhì)量要求降低：DV200 > 30% 即可進行后續(xù)實驗；
● 高靈敏度：獨特的RTL探針設(shè)計，每個基因設(shè)置1~3對捕獲探針，高特異性、高靈敏地捕獲所有基因；
● 芯片配置更靈活：兼具 6.5*6.5 mm和 11*11 mm兩種規(guī)格，較大組織也可一次性完成檢測，適用于更多組織類型；
● 獲得更多的空間見解：通過標(biāo)準(zhǔn)的組織學(xué)技術(shù)預(yù)先篩選組織切片，選擇出最有生物學(xué)意義的切片；
● 縮短實驗周期：使用CytAssist專用玻片和試劑，每次運行可從最多兩張FFPE組織切片中精確捕獲分析物，而時間不到一小時；
● 多組學(xué)分析：提供商業(yè)化的35種蛋白組合試劑盒，可以對同一FFPE樣本進行轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)的同時分析，對基因表達檢測的同時檢測幾十種蛋白。
CytAssist空間轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒灹鞒碳安东@芯片設(shè)計
CytAssist空間轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒灹鞒?/span>
在VisiumﾠCytAssist流程中，切片、脫蠟以及染色和成像（H&E或IF）的步驟是在標(biāo)準(zhǔn)載玻片上進行的。在探針雜交后，將兩張標(biāo)準(zhǔn)載玻片和一張含兩個捕獲區(qū)域的Visium玻片放入CytA ssist儀器中，讓標(biāo)準(zhǔn)載玻片上的組織切片與兩個Visium捕獲區(qū)域的頂部對齊，并通過 Visium CytAssist 儀器捕捉明場圖像，確定感興趣的病理區(qū)域；接著，運行VisiumCytAssist 儀器將普通玻片組織切片上選定目標(biāo)區(qū)域的探針原位轉(zhuǎn)移到 Visium 捕獲區(qū)，Visium 捕獲區(qū)域通過帶有不同位置標(biāo)簽的探針捕獲轉(zhuǎn)錄組信息（探針釋放和捕獲），從而獲取石蠟切片不同空間位置的轉(zhuǎn)錄表達水平。其余步驟（從探針延伸開始）按照Visium FFPE標(biāo)準(zhǔn)流程在儀器外進行。
CytAssist空間轉(zhuǎn)錄組設(shè)計了兩種規(guī)格的捕獲芯片，分別為大小為6.5*6.5mm以及11*11mm的捕獲點陣。每個點陣上包含有55μm直徑，間距100μm的攜帶空間Barcodes和UMI，Poly(dT)的探針群。每張芯片可同時進行2張組織切片的檢測。
CytAssist空間轉(zhuǎn)錄組測序捕獲芯片設(shè)計
常規(guī) Visium vs CytAssist
研究領(lǐng)域
空間轉(zhuǎn)錄組一站式解決方案
空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析流程
空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析展示-基礎(chǔ)分析
空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析展示-高級分析
● Spatial PCA：增加空間聚類準(zhǔn)確性
Spatial PCA是一種空間的降維方法，建立在PCA的基礎(chǔ)上，將定位信息作為額外的輸入，并使用核矩陣來明確地模擬不同組織位置的空間相關(guān)結(jié)構(gòu)。
Spatial PCA是一種空間的降維方法，建立在PCA的基礎(chǔ)上，將定位信息作為額外的輸入，并使用核矩陣來明確地模擬不同組織位置的空間相關(guān)結(jié)構(gòu)。
● BayesSpace：增加空間分辨率
BayesSpace，一種完全貝葉斯統(tǒng)計方法，通過使用來自空間鄰域的信息來增強空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分辨率并進行聚類分析，能夠有效識別具有相似表達譜的空間簇以及提高空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分辨率。
● CellTrek：根據(jù)scRNA-seq和ST數(shù)據(jù)直接將單個細胞映射到組織切片的空間坐標(biāo)SPOTlight：
● Cell2location：將單個細胞參考細胞類型映射到空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集
● SPOTlight：識別每個spot中的細胞類型和比例
官方測試數(shù)據(jù)
● 更高的檢測深度
使用CytAssist的組織測序數(shù)據(jù)的利用率更高，獲得更多的差異表達基因數(shù)量，從而獲取更多有意義的信息。
● 更高的檢測深度
使用CytAssist的組織測序數(shù)據(jù)的利用率更高，獲得更多的差異表達基因數(shù)量，從而獲取更多有意義的信息。
● 更高的覆蓋率（更多的轉(zhuǎn)錄組被探針集覆蓋）和靈敏度
對于人類卵巢癌，CytAssist的數(shù)據(jù)顯示了更高的敏感性和覆蓋率，同時保持了可比性的整體空間組織。
對于人類卵巢癌，CytAssist的數(shù)據(jù)顯示了更高的敏感性和覆蓋率，同時保持了可比性的整體空間組織。
● 更明確的空間聚類結(jié)果
更高的測序深度CytAssist處理的小鼠脾組織具有更明確的空間聚類，個體標(biāo)記物分布更清晰。
更高的測序深度CytAssist處理的小鼠脾組織具有更明確的空間聚類，個體標(biāo)記物分布更清晰。
● 適用于多個領(lǐng)域的研究
輔助識別免疫細胞以及神經(jīng)細胞群等，適用于多領(lǐng)域研究。
輔助識別免疫細胞以及神經(jīng)細胞群等，適用于多領(lǐng)域研究。
案例分析（一）
● 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析損傷后小鼠腸道的愈合情況
發(fā)表雜志：Nature communications
影響因子：17.694
發(fā)表時間：2022.2
發(fā)表雜志：Nature communications
影響因子：17.694
發(fā)表時間：2022.2
實驗設(shè)計
本研究使用10xﾠVisium空間轉(zhuǎn)錄組測序平臺對小鼠冷凍結(jié)腸進行實驗，以研究穩(wěn)態(tài)和黏膜愈合狀態(tài)下的小鼠結(jié)腸空間轉(zhuǎn)錄組的改變。結(jié)果在穩(wěn)態(tài)結(jié)腸中識別以前未被重視的結(jié)腸分子區(qū)域化水平。同時利用與人類IBD患者疾病結(jié)果相關(guān)基因的靶向定位和全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS），分析了IBD的風(fēng)險變異及特異性病理過程。總之，本研究首次繪制了健康和受傷后恢復(fù)狀態(tài)下小鼠整個腸道的基因表達圖譜，揭示了單個基因在組織中的表達位置。
案例分析（二）
● 單細胞聯(lián)合空間轉(zhuǎn)錄組分析揭示異常淋巴發(fā)育程序驅(qū)動肉芽腫形成
發(fā)表雜志：Immunity
影響因子：43.474
發(fā)表時間：2023.2
發(fā)表雜志：Immunity
影響因子：43.474
發(fā)表時間：2023.2
實驗設(shè)計
本研究通過結(jié)合單細胞測序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，對結(jié)節(jié)病患者的肉芽腫進行研究。通過生物信息學(xué)方法重建潛在的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)了一種免疫刺激環(huán)境—重新利用與淋巴器官發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄程序。三種細胞類型在肉芽腫的形成中起著關(guān)鍵作用，包括：巨噬細胞、Th17.1細胞和成纖維細胞。在結(jié)節(jié)病小鼠模型中，靶向基質(zhì)金屬蛋白酶藥理學(xué)抑制減弱了肉芽腫的形成。總之，本研究表明，人類肉芽腫在異常組合中具有正常淋巴器官發(fā)育的特征，產(chǎn)生了一種異常形式的TLSs。
組織包埋經(jīng)驗分享
對于新鮮組織，建議將預(yù)冷好的OCT填充入冷凍模具的底部（可做好標(biāo)記，以確認(rèn)組織方向），然后用鑷子迅速將冰凍好的組織（新鮮組織浸入已液氮浴預(yù)冷的CH3CH2CH-(CH3)2中進行冷凍處理，若無此條件也可以新鮮組織直接進行包埋操作）放入，并用OCT覆蓋組織，使之完全包埋住。該過程應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。然后立即將冷凍磨具轉(zhuǎn)移到粉末狀干冰上。當(dāng)OCT變得完全不透明，包埋成功。對組織進行修理，去掉多余部分，留下需要的組織塊。最后，包埋好的組織塊可放在干冰上運輸至-80°C進行儲存。
組織包埋經(jīng)驗分享
對于新鮮組織，建議將預(yù)冷好的OCT填充入冷凍模具的底部（可做好標(biāo)記，以確認(rèn)組織方向），然后用鑷子迅速將冰凍好的組織（新鮮組織浸入已液氮浴預(yù)冷的CH3CH2CH-(CH3)2中進行冷凍處理，若無此條件也可以新鮮組織直接進行包埋操作）放入，并用OCT覆蓋組織，使之完全包埋住。該過程應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。然后立即將冷凍磨具轉(zhuǎn)移到粉末狀干冰上。當(dāng)OCT變得完全不透明，包埋成功。對組織進行修理，去掉多余部分，留下需要的組織塊。最后，包埋好的組織塊可放在干冰上運輸至-80°C進行儲存。
對于FFPE樣本，請在制備和保存FFPE樣本過程中，盡可能減少因固定包埋操作而引起RNA/DNA/蛋白質(zhì)量下降。目前Visium for FFPE 檢測，對組織的固定包埋方法不做限制。在最后石蠟包埋步驟，建議使用組織包埋盒（圖示），在包埋過程中承載組織樣本，以便進行包埋、組織切片和安全存放。
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