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“iTRAQ”同位素標記相對和絕對定量技術服務
“iTRAQ”同位素標記相對和絕對定量技術
近年來，由美國應用生物系統公司(Applied Biosystems Incorporation，ABI)開發的同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技術是一種新的、功能強大的可同時對四種樣品進行絕對和相對定量研究的方法。
iTRAQ試劑為可與氨基酸N端及賴氨酸側鏈連接的胺標記同重元素(isobaric)。在質譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標記的不同樣本中的同一蛋白質表現為相同的質荷比。而在串聯質譜中，信號離子表現為不同質荷比(114～117)的峰，因此，根據波峰的高度及面積，可以得到蛋白質的定量信息。
雖然DIGE和ICAT已經廣泛應用于蛋白質研究，但是iTRAQ作為一種新的蛋白質絕對和相對定量技術，具有很好的精確性和重復性，并且彌補了DIGE及ICAT的不足。
iTRAQ作為近年來開發的一種新的蛋白質組學定量研究技術，結合非凝膠串聯質譜技術，對復雜樣本、細胞器、細胞裂解液等樣本進行相對定量研究。
實驗流程：
1、 樣本還原、變性、半胱氨酸封閉；
2、 胰蛋白酶消化蛋白；
3、 消化蛋白的iTRAQ試劑標記；
4、 混合標記蛋白到同一個試管內；
5、 LC-MS/MS質譜檢測及分析；
數據分析方案：
1、差異蛋白篩選
我們利用統計學方法篩選差異表達的蛋白。一般認為高豐度蛋白鑒定出多個肽段，低豐度蛋白鑒定出較少肽段，因此檢定出來的肽段數可以直接反映蛋白的表達量。我們認為經過檢驗校正的p-value: p<0.01的基因為差異表達基因。
2、Gene ontology分析
GO數據庫包含了基因參與的生物過程，所處的細胞位置，發揮的分子功能三方面功能信息，并將概念粗細不同的功能概念組織成DAG（有向無環圖）的結構。Gene Ontology是一個使用有控制的詞匯表和嚴格定義的概念關系，以有向無環圖的形式統一表示各物種的基因功能分類體系，從而較全面地概括了基因的功能信息，糾正了傳統功能分類體系中常見的維度混淆問題。在基因表達譜分析中，GO常用于提供基因功能分類標簽和基因功能研究的背景知識。利用GO的知識體系和結構特點，旨在發掘與基因差異表達現象關聯的單個特征基因功能類或多個特征功能類的組合。
對于每一種表達趨勢的基因，選擇性的進gene ontology功能分析。對差異表達的所有基因向gene ontology數據庫的各節點映射。計算每個節點的基因數目，并結合整個數據庫的基因作為背景分部，對于每個節點，得到一個2x2的表格，使用超幾何分布檢驗基因在每個GO節點的富集或貧乏程度。
3、network分析
差異蛋白/基因之間相互網絡構建：
4、Pathway enrichment分析
找出差異表達基因在生物學通路中的位置，以闡明其生物學功能以及不同基因之間的相互作用。首先把差異表達基因定位在生物學通路（Pathway）上，然后進行統計分析，確定差異基因可否可以代表某些生物學通路。
Pathway分析方法：
我們將差異基因使用GenMAPP v2.1向KEGG pathway數據庫映射，并統計基因在每個pathway中的富集程度（enrichment p-value）。
Pathway分析結果：
共找到相關的pathway
5、轉錄因子預測分析
利用相關的轉錄因子（TF）數據庫，將差異基因的啟動子(基因第一個外顯子上游1000bp)提取出來。我們使用HsPD 提供的啟動子序列。轉錄因子數據庫使用TRANSFAC 7.0 public。轉錄因子結合位點預測使用pwmatch 程序，對每個轉錄因子分析其在上調基因和下調基因的分布情況，利用chi-square test 尋找有差異的轉錄因子。
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