檢測自身免疫抗體的蛋白質芯片技術簡介
檢測自身免疫抗體的蛋白質芯片技術
自身免疫性疾病是由異常免疫反應引起的慢性退行性或炎癥性疾病。不同的自身免疫性疾病對機體的影響各有不同。例如，在多發性硬化癥中，自身免疫反應的侵害對象是中樞神經系統，而在克羅恩病中則是腸道。此外，同種疾病對不同個體的組織和器官的影響程度不盡相同。
此類疾病的嚴重程度取決于患者的免疫系統情況。其人群患病率在3%以上，女性和老年人居多。炎癥是許多此類疾病的常見癥狀，其他癥狀包括：眩暈、疲勞、不適及低燒。器官特異性自身免疫性疾病可侵害靶器官或組織，導致功能受損。
對此類疾病的診斷相當困難，尤其是在發病初期。對健康個體進行的特異性自身抗體檢測表明：不同疾病的陽性結果發生率少則接近0%，多則超過10%。健康個體中的大多數抗體的滴定濃度都很低，對健康沒有不良影響。
自身抗體并不總是針對某種風濕性疾病。例如，與天然雙鏈DNA (dsDNA) 發生反應的抗體通常對系統性紅斑狼瘡(SLE)具有診斷意義。但是，抗雙鏈DNA抗體也可見于患有其他疾病的個體中，如風濕性關節炎、干燥綜合癥、硬皮病、藥物性狼瘡、慢性活動性肝炎、格雷夫斯氏病及其他疾病。抗雙鏈DNA抗體在上述疾病的患者中發生率一般低于5%。因此抗雙鏈DNA抗體對SLE沒有診斷意義。
在少數情況下，自身抗體具有很強的疾病特異性。目前已鑒別出一些常見風濕性疾病的自身抗體靶點（表I）。
本文就自身抗體檢測技術進行了回顧性評述，開篇先介紹一些成熟的檢測方法，最后則展望未來的發展趨勢。多路復用蛋白質分析技術是討論的核心焦點。本文還研究了各種多路復用自身免疫測定法，并闡述了開發人員所面臨的困難。
目前的檢測方法
檢測自身免疫相關抗體的第一種方法是瓊脂凝膠平板雙向擴散法，但是這種方法早已被更快速、更靈敏的半定量方法所取代。
檢測血清中自身抗體的常用實驗室試驗：免疫測定（通常為酶免疫測定）、間接免疫熒光顯微技術 (IFA)、免疫印跡及免疫沉淀。上述試驗中只有第一種是半定量試驗；其他均為定性試驗。通過IFA法進行篩查需要耗費大量的人力，而且要求訓練有素的技術人員對顯微鏡染色圖譜進行目測解讀。這種方法缺乏可靠的標準，其結果取決于觀察者的技能。IFA陽性結果并不能確定抗原的存在。因此，在提出具體治療方案的建議方面，其作用十分有限。
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疾病 |
最常見的抗原 | |
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系統性紅斑狼瘡 |
雙鏈DNA、Sm抗原、抗核抗原 | |
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干燥綜合癥 |
干燥綜合癥A抗原 (52和60 kDa)和B抗原 (SSA和SSB)、抗核抗原 | |
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系統性硬化癥 |
拓撲異構酶I、著絲粒蛋白B、抗核抗原 | |
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類風濕性關節炎 |
類風濕因子、環瓜氨酸肽 | |
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格雷夫斯氏病 |
促甲狀腺激素受體 | |
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原發性膽汁性肝硬化 |
線粒體蛋白 | |
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重癥肌無力 |
乙酰膽堿受體 | |
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慢性特發性血小板減少性紫癜 |
血小板抗原 | |
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1型糖尿病 |
胰島β-細胞抗原 | |
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表I. 針對某些主要風濕性疾病最常用的自身免疫分析技術。 | ||
這些方法的最大缺陷是每次分析只能獲得一個結果。通常，為了獲得完整的自身抗體檢測結果，需要進行多次試驗。
長期以來，研究人員希望能夠同時檢測同一類別的多種分析物，如自身抗體、過敏原及甲狀腺功能試驗，而多路復用技術的出現使這一目標得以實現。采用多路復用分析技術時，一份樣品可以在同一個反應器中產生多個報告結果。多路復用技術非常適用于多因素疾病的診斷，這種疾病需要進行多種實驗室檢測方能做出診斷。以復合模式（多路復用技術）對合理設定的多種分析物進行分析具有許多優點：
· 節約試劑、實驗室耗材以及勞動力成本，特別是勞動力成本。
· 通過病人的少量標本即可獲得大量信息，這一點對于兒科尤為重要。
· 能夠同時檢測核酸、抗原、抗體及藥物等多種分析物。
· 具有內部質量控制功能，確保試驗結果的準確性。
· 樣品處理量增大。
· 能夠鑒別分析物濃度的圖譜。
· 通過病人的少量標本即可獲得大量信息，這一點對于兒科尤為重要。
· 能夠同時檢測核酸、抗原、抗體及藥物等多種分析物。
· 具有內部質量控制功能，確保試驗結果的準確性。
· 樣品處理量增大。
· 能夠鑒別分析物濃度的圖譜。
另外，多路復用技術適應了當今工業和市場的發展趨勢，即：勞動力短缺、自動化程度提高、過程標準化以及實驗室聯合。
芯片技術
多路復用蛋白質分析技術最近研制成功，主要包括兩種子技術：平板芯片和球形芯片。
平板芯片：該技術采用一塊二維微芯片，芯片內含針對各種分析所定義的反應位點。通過可溶階段的配合基，平板芯片可以對蛋白質、代謝物及其他分子組成的混合物中的幾種固定化蛋白進行同時檢測。
幾年前，某研究小組制造了一種內置1152個反應位點的自身抗原芯片。這種平板芯片采用聚左旋賴氨酸包被的玻璃載玻片作為固體載體。將196種不同的假定自身抗原以4個或8個復制組的形式進行點樣，由此產生有序陣列。結合在固體基質上的蛋白質包括36種重組或純化蛋白質、6種核酸抗原以及154種重疊和免疫顯性合成肽，這些肽來自于核內小分子核糖核蛋白、Sm抗原蛋白、多聚（二磷酸腺苷-核糖）聚合酶以及H1、H2A、H3和H4組蛋白。在芯片內可進行針對磷酸化激活修飾蛋白的抗體試驗。通常以熒光素Cy3標記的羊抗人IgG作為芯片試驗的標記物。
試驗可以檢測出納克/毫升濃度水平的抗體，而且線性范圍達三個對數。分析靈敏度一般高于酶聯免疫吸附分析法(ELISA)。
此項研究所暴露出的一個技術問題是，幾種Sm抗原和組蛋白因點樣技術被滅活了。據推測，蛋白與固體表面的結合是抗原表位丟失的原因。研究人員表示，或許可以通過優化結合化學性質或者改進表面包被技術來糾正這一問題。此外，一些結合在載玻片上的抗原還受到蒸發速度過快的不利影響。
另一組研究人員也進行了一項試驗，他們把14種自身抗原復本以及空白對照和校準品點樣在聚苯乙烯孔中（圖1），然后將辣根過氧化物酶標記的抗人IgG與可激活的化學發光底物同時使用，并且通過以電荷耦合器件（CCD）攝像機為基礎的芯片檢測儀記錄到了光信號。通過人IgG校準品進行抗體定量。該技術將最常用的臨床試驗整合在一塊簡單的微型芯片上。就分析結果而言，這種塑料芯片與商用分析試劑盒不相上下。
作為臨床試驗室和生物醫學研究的專用自動化平臺，Randox Evidence采用了蛋白質生物芯片技術，通過CCD攝像機對化學發光反應產生的發射光進行探測。
球形芯片：多路復用蛋白質分析技術的第二種子技術采用了一種微球裝置懸浮液，每個裝置代表了一種不同的分析試驗。該系統有時被稱為液體芯片。通過熒光染料對這種微球（直徑約5微米的塑料小球）進行內部編碼，并分別用于多路復用分析的具體試驗。通過流式熒光分光光度法對小球進行檢測。
對微球懸浮液進行自身免疫多路復用分析通常采用Luminex公司（美國德州，Austin）開發的技術。通過該公司的xMAP技術，經熒光團編碼的微球在不同的分析中起到條形碼的作用。6 每個小球裝置可以通過具有不同生物測定特異性的試劑進行包被，分析物由小球裝置中的不同紅光和近紅外線熒光染料濃度確定。這樣就可以對樣品中的特定分析物進行捕捉和檢測（圖2）。分析儀通過一道激光束激活小球的內部染料（這種染料將微球分為不同類別），而另一道激光則激活報告染料（通常是B-藻紅蛋白），測定過程中該激發光將被捕捉。各小球裝置可以獲得幾十個到幾百個讀數。
Luminex 100流式設備通過數字信號處理技術按照預先設定的分布區域對各個微球進行分類。每個微球表面都含有多個羧基，這些羧基可以作為蛋白質共價連接的位點。通過一系列校準品對小球表面的報告染料進行定量測定。
微球具有較小的體積和較大的表面積，比平面固相芯片具有更好的反應動力學性能。而且，微球在懸浮液中的流動性也優于靜態平板芯片。將樣品均勻分布到所有平板芯片區域極為關鍵，但是對于懸浮芯片這一點卻無關緊要。
目前已有多篇利用Luminex技術進行自身免疫研究的研究報道。其中一個試驗同時檢測了5種可提取性核自身抗原，與公認的單一試驗ELISA法相比具有良好的相關性。另一個小組研究了37名干燥綜合癥患者血清中的抗核抗原(ANAs)和可提取性核抗原。他們分別在84%和76%的患者血清中檢測到干燥綜合癥A抗原和B抗原(SSA和SSB)的抗體。
Bio-Rad Laboratories公司(美國加州，Hercules)的BioPlex 2200 ANA篩查儀是一種以Luminex為基礎的全自動系統，可以同時測定13種自身免疫抗體的水平。一項臨床研究表明，這種ANA篩查儀的特異性與ELISA ANA篩查試驗不相上下。 與ELISA試驗相似，該BioPlex系統的陽性率低于用于自身抗體篩查的間接免疫熒光試驗。
優點和缺點：這兩種多路復用技術（懸浮和平板芯片）各有優缺。二維微芯片技術在蛋白質或核酸的高密度篩查（包括100多種的試驗）方面非常出色。平板芯片尤其適用于單一試驗中對從細菌到人的各種生物體的整個基因組或蛋白質組進行同時分析。微球芯片在臨床試驗室中的優勢尤為突出，這些試驗中的檢測分析物都是精心設定而且通過較小的面板進行測定。
微芯片技術有時缺乏高通量臨床應用所必需的重復性。這主要是因為平板芯片的制備需要序列化的生產過程。相反，微球芯片的大量生產具有平板芯片不易達到的分析重復性。
此外，平板芯片的超靜定性和統計檢驗水平也不如微球芯片。這是因為每個測定裝置在一次多路復用小球反應中通常會檢測數百個微球，每個小球代表一種不同的免疫測定，而且在計算結果前即可將數據集中的異常值排除在外。
懸浮芯片有助于根據客戶要求將配合基與每個小球裝置進行偶合。結合在不同小球裝置上的配合基可以在不同結合化學性質和反應條件下進行反應。每種配合基的純度可能各不相同，例如有的像細胞裂解液一樣，而有的像重組蛋白一樣。每個小球裝置與配合基之間可以使用不同的接頭。最后，在每個小球裝置制造時可以采用不同的包被后或封閉步驟。
微球芯片具有顯著的優勢：每個微球裝置均以最佳方式單獨加工，隨后將不同的小球裝置組合起來制備最終的多路復用小球試劑。
芯片檢測中可以容納大量的分析物，因此可以使用多個內部對照以確保測定系統的預期性能。自身抗體的多路復用分析中可能需要不同的對照（表II）。
相對熒光是芯片技術中常用的輸出信號。可以使用熒光內部標準（獨立小球裝置或芯片位點）對所有測定信號進行標準化。這種標準化彌補了照明和檢測系統的波動。還可以根據相應的臨床標本類型及和加樣容積設計自身免疫測定中的其他內部檢測。這些內部對照是每個多路測定試驗必須具有的功能。
多路復用檢測中還可以考慮使用對一種分析物或一類分析物具有特異性的其他內部對照。例如，通過類風濕因子(RF)內部測定可以檢測RF對IgM自身抗體分析的潛在干擾。檢測總IgG將有助于確保IgG高丙種球蛋白標本不會由于競爭性抑制而干擾IgM分析。
正確使用內部對照需要掌握分析物的相關技術問題、進行測定的基質以及所用設備的性能特點。內部對照的使用可以提高測定的精度和準確性，并且可以排除未知的矛盾結果。
技術難點
多路復用自身免疫測定法的普遍認存在一些技術障礙。與核酸芯片相比，蛋白質芯片的開發難度更大。這是因為蛋白質在分子大小、電荷、外形、疏水性、基因轉譯后形成的類型和程度、以及四級結構方面具有很大區別。而且一些蛋白質連接在固相載體上后難以保持特異性和活性。
對自身抗原進行同時檢測，正如使用各種免疫分析方法一樣，需要合理設定的、可重復性、可調定量抗原。利用芯片技術進行自身抗原測定存在一些問題，包括如何獲得芯片構建所需的功能蛋白表達、開發將蛋白質連接到載體表面并保持其活性的技術以及通過化學和檢測系統同時獲得較高的分析靈敏度和較大的動態范圍。測定標準化、數據解釋及儲存也是需要考慮的問題。而且對每種分析物都需要進行性能驗證。此外，由于經常存在基因轉譯后形成的各種變體，蛋白質化學非常復雜。
重復性：多路復用分析技術可以影響分析結果的重復性。通過對所有試劑和反應過程進行廣泛優化以及重復檢測可以達到較高的精度。使用平板芯片時，可能要對每種分析物的兩個或多個復本盡心檢測，然后對變異可接受性進行統計檢驗，并計算出平均值。使用球形懸浮芯片時，通常要對每種分析物的數百個小球或化驗結果進行測定。一般來說，小球的數量與化驗精度存在直接聯系。
干擾性：芯片位點之間的相互干擾是一個嚴重的問題。使用平板芯片時會出現這種信號干擾，但理論上，這種干擾對微球芯片的影響更大。在微球懸浮芯片中，測定反應中心并未分割成獨立的空間位點；各個小球裝置在使用前有可能在液相中發生長時間的相互作用。
與微球反應的蛋白質主要通過共價鍵連接，但是，即使徹底清洗后通常還會有一些疏松連接的蛋白質。與小球裝置非共價連接的蛋白質會從固相表面緩慢解離，并抑制液相反應物的正常反應；結果就可能出現假陰性。解離的蛋白質也可能遷移并依附到另一小球裝置的表面，導致假陽性結果。
應進行全面的穩定性試驗，以確保結合了配合基的蛋白質在產品保存期內都可與固相基質穩定結合。在多路分析驗證階段，必須確保多路復用分析的結果與相應的單路分析結果相當。穩定性試驗最好在標稱的保存期末進行，這時最容易發現問題。只有所有分析物的多路和單路分析結果都近乎相同時，研究人員才能認定小球裝置的混合并未產生相互干擾(圖3)。
多路復用測定中潛在的相互作用數是微球芯片中測定次數的一個函數（表III）。隨著芯片復雜程度的增加，各分析之間可能發生的不良作用也快速增加。生產前必須解決這一干擾問題。
靈敏度和特異性：通過自身抗體芯片獲取臨床的靈敏度和特異性非常困難。自身免疫抗原通常沒有顯著的特點，而各種分析法中的主要反應成分在純度、濃度及活性方面均不相同，因此很難獲得等效的結果。自身抗體測定通常是在非平衡狀態下進行的。各種分析法在分析動力學和熱力學方面存在差異，從而產生不同的分析結果，特別是對于中等濃度的自身抗體。
從本質上說，多路復用測定法會產生多余的信息。自身抗體芯片最有價值的功能就是它可以產生自身抗體的圖譜。人們希望借助計算機圖譜識別軟件對多路復用芯片的結果進行分析，從而進行疾病的差別性診斷。這種軟件不僅可以提高診斷的準確性，還可以提高分析的通量和成本效益。此外，計算機程序還可以發現未經識別的復雜自身抗體的圖譜。
目前，用于構建專家系統和解釋算法的方法多種多樣。圖譜識別技術的誘人之處在于其假設的獨立性，同時無需專家對每個結果進行主觀性解釋。圖譜識別對受測分析物的名稱或特征無任何要求。
方法多樣化
在一項研究自身抗體圖譜能否預測小鼠對1型糖尿病的耐受性或易感性的試驗中，研究人員將一組共266種抗原點樣在玻璃芯片上。抗原中的肽分別來自熱休克蛋白、組織抗原、免疫系統成分、結構抗原、激素、酶、血漿蛋白、合成寡核苷酸及細菌抗原。在這組266種原始抗原中，研究人員發現一個27種抗原的組合可以將小鼠區分為化學促發型糖尿病（環磷酰胺促發型糖尿病；CAD）耐受個體和易感個體。
研究人員發現，通過自身抗體圖譜可以區分CAD易感小鼠和耐受小鼠，這種鑒別甚至可以在給予促發化學物前進行。研究還發現一種自身抗體圖譜可以區分健康小鼠和CAD后糖尿病小鼠；該圖譜與CAD前抗原集的自身抗體圖譜有所不同。因此，在糖尿病的發病中，可以通過IgG對某些抗原的反應性預測個體對于CAD的潛在易感性，而不是CAD本身。另一方面，一些IgG反應性可以預示疾病而不是易感性。因此，對潛在疾病的預測以及對當前疾病的診斷可能有賴于不同的自身抗體效價圖譜。
該研究列舉了定義各種風濕性疾病自身抗體圖譜的多種方法。人們可能還將發現新的抗體圖譜，用以預測自身免疫疾病的病變過程，或提示可取的治療方案。
未來應用
在一些重要的未來研究和臨床應用中，基于自身抗體芯片的多路復用技術前景一片光明。最明顯的例子就是，為了進行有效的診斷和治療，對可能反映某一具體自身免疫性疾病的大量抗原進行篩查。其他潛在應用包括：鑒定潛在致病性評估中的相關人IgG類型、鑒別自身免疫反應的抗原表位分布以及指導抗原圖譜明確性治療的療程。3 多路復用測定法有助于發現尚未鑒別的自身免疫性疾病或疾病亞型的新型自身抗原。
同時還可以將這種技術用于其他醫學領域，如對變應原、治療性和濫用藥物、血清抗體以及心臟病和癌癥蛋白質標志物的分析。
高數值芯片（含100多種分析物）將成為研究環境中最有用的技術。通過對成百上千種試驗進行多路復用，研究人員可以從與某種疾病無臨床關系的大量分析物中鑒別出數量有限的自身免疫生物標志物。經過這一階段，陣列密度低于100種分析物的蛋白質即可投入臨床應用。
結論
標簽：
自身免疫抗體 蛋白質芯片
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