α7nACh 受體的競爭性拮抗劑對實驗小鼠學習記憶能力的影響

摘要:目的　探討α7nACh 受體的競爭性拮抗劑(MLA) 對實驗小鼠在Morris 水迷宮中學習記憶能力的影響。

方法　雄性昆明小鼠每天腹腔注射MLA (110、418μg/ g ) ,連續8d ,采用Morris 水迷宮,通過定位航行、空間探索試驗觀察分析小鼠的學習記憶能力。結果　小鼠腹腔注射MLA 418μg/ g 與其余三組相比,尋找平臺潛伏期明顯延長( P < 0101) ,在目標象限游泳時間所占百分比也明顯降低( P < 0101) ,結論　腹腔注射MLA 418μg/ g的小鼠有學習和記憶能力的下降。

關鍵詞:α7nACh 受體的競爭性拮抗劑;Morris 水迷宮;學習記憶能力;小鼠

　　α7nACh 受體的競爭性拮抗劑是燕草屬植物飛燕草子(Delphinium spp1) 的提取物甲基牛扁亭(methyllycaconitine ,MLA) ,為一種植物毒素[1 - 2 ] 。近年來的動物實驗研究表明, MLA 通過對α7nACh 受體的競爭性拮抗, 導致動物認知功能障礙[3 - 4 ] 。本實驗采用腹腔注射法, 用Morris 水迷宮檢測小鼠的學習記憶能力, 擬建立一種模擬α7nACh 受體損傷的癡呆模型, 以進一步為研究α7nACh 受體在阿爾茨海默病等退行性神經系統疾病的作用機理和針對治療α7nACh 受體損傷的藥物開發提供實驗依據。

1 　材料和方法

111 　實驗動物和分組　選用健康雄性3 個月齡昆明小白鼠(購自寧夏醫學院實驗動物中心) 85 只,隨機選取35 只用于確定最大逃逸潛伏期實驗,其余50 只,在正式開始實驗的前一天,小鼠依次在Morris 水迷宮中自由游泳2min ,選取游泳姿勢和速度符合要求的小鼠40 只,隨機分為4 組,每組各10 只。1) 正常對照組:小鼠自由進食飲水,自然晝夜節律光照;2) 生理鹽水組:注射等量生理鹽水;3) 110μg/ g組:每天注射MLA 110μg/ g ,連續8d ;4) 418μg/ g 組:每天注射MLA 418μg/ g ,連續8d。

112 　試劑和儀器　MLA:粉劑,購自Sigma 公司。Morris 水迷宮及微機生物機能系統,購自成都泰盟科技有限公司。

113 　MLA 溶液制備及給藥劑量　臨用前將110μg/ g 和418μg/ g 的MLA 分別溶解于生理鹽水中,按011mL/ 10g 的

劑量連續注射8d。

114 　Morris 水迷宮行為測定　水迷宮為圓形水池,池壁為乳白色,壁上標有東、南、西、北四個入水點,將水池等分為SW、MW、SE 及NE 四個象限,在SW象限正中放圓形透明平臺,平臺頂低于水面1cm ,水溫(26 ±1) ℃,水中加入適量牛奶,至看不清水下平臺。迷宮正上萬懸掛攝像機并連接計算機等記錄顯示系統,實驗期間保持環境安靜,迷宮外參照物(如門、窗、冰箱、電燈) 等保持不變。

11411 　最大逃逸潛伏期的確定:選取的35 只小鼠,分上、下午兩個時段進行水迷宮訓練,每個時段訓練4 次,訓練時小鼠先自由游泳2min ,適應環境后將小鼠面向池壁放入水中,記錄每次從入水點至找到平臺的最大時限。訓練時操作者隨機選擇一個入水點,但在同一個訓練時段內,每只小鼠的入水點相同。120s 內找不到平臺,將小鼠引導至平臺上休息10s ,連續2d ,記錄找到平臺的時間。實驗結束后,

選取90 %以上小鼠找到平臺的時間,確定為最大逃逸潛伏期。

11412 　注射MLA 動物定位航行試驗(place navigation) :將篩選并分組的小鼠,從第1 天起,按11411 方法訓練5d ,記錄潛伏期及游泳速度,取后3d 的算術平均值進行統計分析。注射MLA 后按同樣的方法繼續訓練,連續8d ,取8d 的算術平均值進行統計分析。

11413 　注射MLA 動物空間搜索試驗( spatial probe test) :在訓練第5d 和注射MLA 8d 后,撤除水下平臺,于平臺象限池壁中點為入水點,記錄小鼠120s 內搜尋平臺在各象限的游泳時間。

115 　統計學方法

所有數據用(.x ±s) 表示,采用單因素方差分析(Oneway ANOVA) ,方差齊性時,用LSD(Le Significant Difference)或Student Newman Keuls 檢驗進行兩兩比較,方差不齊時,用秩和檢驗,組間比較Kruskal Wallisttest。采用SPSS 1110 統計軟件對數據進行統計分析。

2 　結果

211 　最大潛伏期測定結果　35 只小鼠中,2 只原地打轉,

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Journal of Ningxia Medical College

第28 卷　3 期

　2006 年6 月

不符合實驗要求被剔除。33 只小鼠中有31 只經2d (16 次)訓練,能夠在第16 次訓練后70s 以內找到平臺,超過總數

的90 % ,因此,確定最大潛伏期為70s。

212 　注射MLA 動物定位航行試驗

21211 　逃逸潛伏期:訓練5d 后,各組與正常對照組逃逸潛伏期比較差異無統計學意義( P > 0105) ; 注射MLA 后,

418μg/ g 組和正常對照組比較逃逸潛伏期明顯延長,有統計學意義( P < 0101) ,其余各組與正常對照組比較逃逸潛伏期差異無統計學意義( P > 0105) ,見表1。

21212 　游泳速度:訓練5d 后和注射MLA 后,實驗各組與正常對照組速度比較無統計學意義( P > 0105) ,提示注射生理鹽水和MLA 后小鼠的運動能力沒有受到影響(表1) 。

 

表1 　各組小鼠定位航行試驗尋找隱匿平臺的平均潛伏期和平均速度

組別                     潛伏期(s)                            游泳速度(cm/ s)

訓練5d             注射MLA 8d            訓練5d               注射MLA 8d

正常對照          33.03 ±1.61           18.46 ±1.41          12.42 ±1.92            11.05 ±1.19

生理鹽水          32.68 ±4.99           17.11 ±1.45          11.12 ±1.29            11.84 ±4.03

MLA 110μg/ g      31.54 ±4.99           15.11 ±1.46          13.09 ±3.21            10.56 ±1.59

MLA 418μg/ g      29.65 ±5.34           47.95 ±9.313            11.21 ±1.35             10.13 ±0.59

　與對照組潛伏期比較3 P < 0101

213 　注射MLA 動物空間搜索試驗　訓練至第5d ,各組與正常對照組平臺象限停留時間百分比比較無統計學意義( P > 0105) ;注射MLA 后,418μg/ g 組和正常對照組平臺象限停留時間百分比比較有統計學意義( P < 0101) ,其余各組與正常對照組比較無統計學意義( P > 0105) ,見表2。

 

 

表2 　各組小鼠空間探索實驗在目標

組別                      平臺象限停留時間百分比( %)

訓練5d                    注射MLA 8d

正常對照              45.12                         47.61

生理鹽水              49.52                         45.33

MLA 110μg/ g          41.87                         45.62

MLA 418μg/ g          41.23                         29.98*

　與對照組比較*P < 0101

3 　討論

隨著學習記憶腦機制研究的不斷深入,以及尋找有效防治認知障礙類疾病方法的需要,客觀準確地評價實驗動物的學習記憶水平已經成為神經生物學和神經藥理學中非常重要的研究內容。Morris 水迷宮是英國心理學家Morris 于20 世紀80 年代初設計的,主要應用在學習記憶的神經生物學機制探討和神經藥理(包括中藥藥理) 的研究[5 ] 。但Morris 使用這一迷宮測試方法所針對的對象是大鼠,經過查閱資料發現亦有將之應用于小鼠的,但訓練方法有所不同[6 - 8 ] ,在我們的測試中,訓練為5 d ,分上、下午兩個時段,每段訓練4 次,實驗至第3 天基本穩定,提示Morris 水迷宮也適用于小鼠的記憶行為測試。測試35 只小鼠,將最大潛伏期確定為70s ,在本實驗中是比較合適的,既排除了因訓練時間不同,而造成小鼠記憶能力的差異,也節省了時間,確保實驗的完成。但由于訓練的工作量大,工作人員少,測試的樣本量較少,對于更準確地確定小鼠的最大潛伏期合適范圍還需要進一步的研究。Morris 水迷宮的實驗數據較為復雜,其統計分析難度也較大,尤其是小鼠在定位航行中所測得的逃避潛伏期如何進行統計學分析既往存在的問題較多。在本實驗中,根據正常對照組的小鼠,通過5d 的訓練期和8d 測試期,逃逸潛伏期逐漸減少,但在訓練2d 后基本趨于穩定,因此,取后3d 的平均逃避潛伏期作為平均訓練潛伏期進行統計分析。a7nACh 受體在阿爾茨海默病(AD) 的早期就有缺失,認為是AD 的早期癥狀,因此人們開始試圖以a7nACh 受體為靶點,研究其結構、分布和功能與AD 的關系。但由于神經元煙堿受體( nAChR) 亞型之間差別很小,數量又很多,就α7nACh 受體亞型也不僅有種屬差異,而且隨年齡的變化而有改變,因此,要尋找α7nACh 受體亞型特異性拮抗劑或激動劑是非常艱難的,雖然近年來在合成競爭性特異性激動劑方面取得一些進展[9 ] ,但具有高親和性特異性高的拮抗劑還是很少的,目前僅有a -bungarotoxin[10 ]和a - conotoxinI2mI and methyllycaconitine(MLA) [11 ] 。MLA 對哺乳類動物的神經型a7nACh 受體的親和性比其它煙堿受體都要高。本實驗中腹腔注射MLA 110 、418μg/ g 后,發現MLA 對小鼠的記憶有損害,且有劑量依賴性,提示可以通過選擇適當劑量的MLA ,擬建立一種模擬a7nACh 受體靶點損傷的動物模型,為進一步研究α7nACh受體在AD 等神經系統退行性疾病的作用機理和針對治療α7nACh 受體損傷的藥物開發提供依據。