腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 ( brain derived neur otr ophic fact or,BDNF)在腦內(nèi)分布廣泛 ,大腦皮層、 海馬及基底前腦是其主要分布區(qū) ,在基底前腦的膽堿能神經(jīng)元及其末梢發(fā)現(xiàn)了 BDNF的受體 [ 12 3 ]。運動促進腦損傷后膽堿能神經(jīng)元軸突的出芽再生 ,可能與 BDNF的增多有重要關(guān)系。本研究旨在探討運動訓練是否可使小鼠大腦中動脈閉塞 (middle cerebral artery oc2clusi on, MCAO)后 BDNF mRNA表達水平發(fā)生改變。

材料與方法

一、 材料

選雄性 C57 BL /6J小鼠 26只,體重為 20～30 g,鼠齡為 3～5個月。

二、 方法

(一 )動物分組和運動訓練方法

按 Beders on等[ 4 ]的方法 ,建立小鼠 MCAO模型 ,MCAO術(shù)后第 3天開始運動訓練。隨機將 26只小鼠分為運動 Ⅰ組 ( 9只 ) ,運動 Ⅱ 組 (9只 )及對照組 ( 8只 )。運動 Ⅰ組每天于跑籠中訓練1 h,共訓練 90 d;運動 Ⅱ 組先于跑籠中運動 15 d,停止運動 30 d,再置于跑籠中運動45 d,每天訓練 1 h,其它處理與 Ⅰ 組相同;對照組每次置于跑籠中 ,但跑籠不轉(zhuǎn)動。90 d后斷頭取大腦。

(二 ) BDNF基因mRNA表達的定量 RT2 PCR測定11腦組織中RNA的提取:小鼠BDNF引物是根據(jù)鼠神經(jīng)細胞上BDNF mRNA全序列[ 5 ]( gene bank accessi on no .X55573)而設計的 ,其序列為F 5′2GGA TG A GGA CCA GAAGGT TCG2 3,其位點為 296～316; R 5′2 ACC CTC AT A G AC ATGTTT GCG G2 3′,其位點為 460～439,由上海生工生物工程公司合成 ,擴增長度為 164 bp,使用濃度為 10 nmol /ml。腦組織中RNA的提取按 TR I zol Reagent試劑盒說明書進行 ,電泳得到5S、18S、28S總RNA條帶 (圖1)。同時用紫外分光光度計( Phamacia Ultrospec 2000 )測A260和A280的OD值 ( 1OD =40μg/ml RNA) ,計算所提取的總 RNA量 ,并使每次 A260 /A280比值保持在 1 . 8以上 ,置于 - 70℃下保存待測 ,于 1周內(nèi)測定完畢21逆轉(zhuǎn)錄 (RT) 2 單鏈 cDNA的合成:等量取上述每個標本總RNA 2μg,分別逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。BDNF反應體系 (20μl) 5×RT Reacti on Buffer 2μl, 10 mmol /L dNTP 1μl,上、下引物各0 . 5μl (12 pM) ,MMLV2 逆轉(zhuǎn)錄酶 10 u,樣品 RNA 2μg, Rnasin 10 u, DEPC外理的 dH2O加至10μl。反應條件: 37℃水浴下 60 min, 95℃下 5 min,即逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA,作為模板 ,于 - 20℃ 下保存待測。31RT2 PCR反應:分別取上述逆轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)品 cDNA 10μl與BDNF引物作 PCR。反應體系:模板 cDNA 10μl, Taq DNA聚合酶 1μl, 5 × RT Reacti on Buffer 4μl, 10 mmol /L dNTP 2μl,引物上游0 . 5μl、下游 1μl加水至 30μl,混勻后加入適量石蠟油 ,離心數(shù)秒鐘 ,按下列條件擴增: 93℃預變性 3 min,此后 93℃30 s→57℃30 s→72℃45 s,共做 35個循環(huán)后, 72℃ 延伸5 min,取反應管中 RT2 PCR產(chǎn)物 5μl與 1μl溴酚蘭指示劑充分混勻后,于 2%瓊脂糖凝膠上電泳 (10 V / cm) 10～30 min,于凝膠成像及分析裝置上觀察結(jié)果。41RT2 PCR定量檢測 cDNA含量 (即 mRNA表達量 ) : RT2PCR割膠純化 ,嚴格按 Qiiagen公司純化試劑盒 (Qiaex II Gel,Extracti on Kit)的說明書進行。純化后的 RT2 PCR產(chǎn)物 ,在紫外分光光度計上測 A260的 OD值 (A260的 1OD = 50μg/ml cDNA) ,測得 cDNA濃度為 200μg/ml,取 5μl ( 1μg cDNA)做標準曲線 ,行系列的 10倍稀釋 ( 10- 3～10- 11μcDNA) ,各樣品同樣亦取 5μl一起進行 PCR。PCR的反應體系 (20μl) : RT2 PCR產(chǎn)品5μl,標準品行 10倍系列稀釋后亦各取 5μl, Tag酶 1 . 5μl, 5 ×RT Reacti on Buffer 6μl, 10 mM dNTP 2μl,上、 下游引物各1μl,加水至 20μl,混勻后加入適量石蠟油離心數(shù)秒鐘。按下列條件擴增: 93℃ 預變性 3 min,然后 94℃ 45 s、 57℃ 45 s、 72℃1 min、 共做 30個循環(huán)后 , 72℃ 延伸 5 min,取反應管中下層液相即 RT2 PCR產(chǎn)物 5μl,與 1μl溴酚蘭指示劑充分混勻后 ,于 2%瓊脂糖凝膠上電泳 (10 V / cm) 20～30 min,見圖 2, 3。各樣品條帶的峰面積值均在標準品峰面積值范圍之內(nèi) ,用標準品的濃度和峰面積值在凝膠成像和分析裝置上照相 ,用 Gel Base /GelBl ot Support軟件對底片的電泳帶行掃描分析。

三、 統(tǒng)計學分析

用 SPLM軟件計算 ,以標準品濃度與峰面積做標準曲線 ,并進行曲線擬合 ,選出最優(yōu)曲線 ,代入樣本峰面積 ,算出 cDNA濃度 ,即為 mRNA 初始表達量。用非參數(shù)多樣本比較 ,Kruskal2 Wallis檢驗 3組差別。用 W ilcoxon檢驗做兩兩比較。