對(duì)真菌細(xì)胞進(jìn)行破壁，提取其DNA。

實(shí)驗(yàn)原理

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)展，PCR相關(guān)方法越來越多地被應(yīng)用到真菌學(xué)研究中來，而真菌DNA的提取是包括分子診斷在內(nèi)的所有實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，簡(jiǎn)便快捷地提取真菌DNA，且獲得的DNA完整、純度高，對(duì)真菌分子生物學(xué)的研究有及其重要的意義。

真菌細(xì)胞壁以幾丁質(zhì)、葡萄糖為主構(gòu)成細(xì)胞壁骨架，而基質(zhì)則由多糖、甘露聚糖、糖蛋白、脂質(zhì)等填充。絲狀真菌堅(jiān)韌厚壁的構(gòu)成，需要較為繁瑣的破壁手段，故真菌DNA的提取較細(xì)菌或其他組織細(xì)胞難度更大。為保證真菌PCR技術(shù)及其相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)的順利開展，簡(jiǎn)便快捷地提取真菌DNA，且獲得的DNA完整、純度高，是必須解決的前提條件。

實(shí)驗(yàn)材料和器具

樣品：真菌類

儀器：高通量組織研磨儀（上海凈信，Tissuelyser-48）

耗材：離心管（上海凈信，2ml），研磨珠（上海凈信，6號(hào)，1顆）

試劑：TE Buffer，DA Buffer，E Binding Buffer，Elution Buffer

實(shí)驗(yàn)步驟

方法1

1.1 取0.1g菌絲加入2ml離心管中，加400μLTE Buffer，加入石英砂100mg；

1.2 將離心管放入上海凈信科技的高通量組織研磨儀Tissuelyser-48中，設(shè)置頻率65hz，研磨10min；

1.3 取出離心管于65°C環(huán)境中溫浴30min，然后移出；

1.4 加入130μL DA Buffer，混合均勻后于冰浴中放置5min；

1.5 放入離心機(jī)14000r/min離心3min；

1.6 將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5ml離心管中，加750μL的E Binding Buffer，并混合均勻，將混合液體轉(zhuǎn)移至Spin column；

1.7 放入離心機(jī)6000r/min離心1min，棄去接液管中液體；

1.8 Spin column中加入600μL的Wash Buffer，于10000r/min離心30s，棄去接液管中液體；

1.9 重復(fù)步驟1.8，棄去接液管中液體后，再10000r/min離心60s，Spin column轉(zhuǎn)到新的EP管中；

1.10 Spin column中加入150μL Elution Buffer，室溫放置1min。12000 r/min離心60s，并棄去Spin column。

方法2

2.1 取0.1g菌絲加入2ml離心管中，加400μL10×TE Buffer，加入石英砂100mg；

2.2 將離心管放入上海凈信科技的高通量組織研磨儀Tissuelyser-48中，設(shè)置頻率60hz，研磨2-3min；

2.3 加入120μL10%SDS，加入10μL蛋白酶K，混勻，65°C環(huán)境中水浴30min；

2.4 然后渦旋1min，加入120μL5M NaCl，加入1/10體積的10%CTAB（約65μL）；2.5 于65°C水浴60min，渦旋1min；

2.6 抽提，加入1/2體積（約350μL）的Tris飽和酚及1/2體積（約350μL）的氯仿：異戊醇（24:1），混勻；

2.7 于離心機(jī)14000轉(zhuǎn)離心1min，取上清液到另一離心管中；

2.8 重復(fù)步驟2.7 2-3次（視兩相界面雜質(zhì)多少而定）。

2.9 加入等體積氯仿：異戊醇（24:1）混勻，14000轉(zhuǎn)離心10min，取上清液至另一離心管中；

2.10 最后開始沉淀，加入225μL  NH4Ac，輕柔混勻，冰水中放置30min，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，14000轉(zhuǎn)離心10min，棄上清液；

2.11 用1000ul70%乙醇清洗沉淀，室溫晾干，加50ul TE Buffer溶解沉淀。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

               圖1 提取DNA的檢測(cè)  M：100bp 標(biāo)準(zhǔn)參照物

             圖2 提取DNA的PCR檢測(cè)結(jié)果  M：100bp 標(biāo)準(zhǔn)參照物