細胞遷移與侵襲全攻略
瀏覽次數(shù)：5325 發(fā)布日期：2019-7-3
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小室操作處理的步驟
Step1.選擇水凝膠類型包被小室：
水凝膠主要分為兩種：動物來源（如基質(zhì)膠、膠原蛋白膠、纖維蛋白膠）或是合成型水凝膠（如Vitrogel 3DTM）。以24孔板的小室為例，取70-100μl（體積量不需太多，剛好將聚碳酸酯膜浸濕即可）稀釋好的水凝膠，均勻涂抹在小室內(nèi)的膜進行包被，37℃放置1-3 h左右(時間取決于選用的水凝膠類型)。
▲細胞遷移和侵襲實驗圖示
Step2.制備細胞懸液:
將進行實驗的細胞消化下來，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1-2次，用不含血清培養(yǎng)基將細胞重懸，并進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度至5×104/ml -5×105/ml (根據(jù)實驗決定細胞接種數(shù)量)。
Step3.接種細胞：
取100µl細胞懸液加入24孔板上層小室，24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培養(yǎng)基，避免下層培養(yǎng)液和小室間氣泡產(chǎn)生，氣泡會減弱下層培養(yǎng)液的趨化作用，如果不小心出現(xiàn)氣泡，需要將小室提起，將氣泡除去，再將小室放進培養(yǎng)板。
Step4.培養(yǎng)時間：
培養(yǎng)時間由實驗目的決定，如細胞共培養(yǎng)、細胞趨化、細胞遷移以及細胞侵襲等多種方面的研究；細胞遷移與侵襲的能力，除了培養(yǎng)時間需要考慮外，也需考慮細胞的處理！
Step5.結果分析：
結束培養(yǎng)，取出小室，移除孔中培養(yǎng)液，用無鈣鎂的PBS洗2-3次，使用甲醇固定15-30分鐘后，將小室適當風干。用預備好的0.1%-0.5%結晶紫染色，再用棉簽輕輕擦掉內(nèi)層未遷移細胞，用PBS洗3次。在200倍或400倍顯微鏡視野下，隨機選擇五個視野拍照觀察并計數(shù)穿過膜后的細胞。
▲統(tǒng)計穿膜后細胞數(shù)量圖示 |
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Reference
Transwell® Invasion Assays. Methods Mol Biol. 2011; 769:97-110 |
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