細(xì)胞凍存與復(fù)蘇小課堂

瀏覽次數(shù)：4467　發(fā)布日期：2019-8-15　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

電影《太空旅客》里，未來的地球人搭太空船移民其他星球，上百年的飛行時光中，人們躺到休眠艙里保存有限的生命，男主角 Jim 是其中一名乘客，卻意外提早了 90 年起床，故事就由此開始。
相信做過長期細(xì)胞實驗的各位都知道，凍存細(xì)胞很重要，就像知道未來星際旅行要躺到休眠艙里睡覺一樣！但，你明白其中的道理嗎？

細(xì)胞凍存的好處

節(jié)省實驗室空間、我們的時間和老師的經(jīng)費。
給失敗的實驗，多幾次洗心革面的機會。
確保重復(fù)實驗的一致性。
確保未來實驗的連接性。

所以這看似小小的一步，其實非常重要啊！

細(xì)胞凍存的基本原理：

細(xì)胞代謝過程需要各種蛋白酶的參與，而這些蛋白酶在環(huán)境溫度低于-70℃ 以下時會集體罷工，使代謝活動近乎停止，細(xì)胞因此進入睡美人狀態(tài)，使細(xì)胞「不會老」，所以可以長期保存。冷凍凝固的過程中，水分會在 0℃～-20℃ 區(qū)間形成不同形狀的結(jié)晶「下圖 1」，因此在細(xì)胞凍存時「降溫速度、冰晶形成量和細(xì)胞滲透壓改變程度」是影響凍存成功與否的重要關(guān)鍵。

▲圖1：0℃~-20℃ (紅色區(qū))，冰晶生成量最多。(Fesenmaier,2011)

■　降溫速度慢：冰晶由細(xì)胞外開始形成，造成胞外滲透壓變小，細(xì)胞內(nèi)水份移動至細(xì)胞外，造成細(xì)胞脫水皺縮。
■　降溫速度快：水分流動時間短，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓改變程度小，但大量水分留在細(xì)內(nèi)造成大量胞內(nèi)冰晶形成，使胞器損壞。

這些影響都會讓細(xì)胞損傷、細(xì)胞凋亡或壞死，也可能造成復(fù)蘇后細(xì)胞存活率低、細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞功能喪失、基因或蛋白質(zhì)組分變異等現(xiàn)象。由此可知，最適合的凍存條件為「在增加細(xì)胞滲透壓穩(wěn)定性的溶液中，以慢到能減少胞內(nèi)冰晶形成、但也足夠快到能預(yù)防細(xì)胞脫水的降溫速度凍存細(xì)胞」「下圖２」。

▲圖２：降溫速度對細(xì)胞造成的影響

最溫柔的凍存液：

細(xì)胞凍存液體中的「抗凍劑」是維持細(xì)胞滲透壓平衡的關(guān)鍵，常見的成分有 DMSO、甘油等。這些成分能在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，平衡細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓，避免細(xì)胞過分脫水皺縮、也能同時減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成；但這類成分對細(xì)胞有一定的毒性，所以需要使用高濃度血清來保護細(xì)胞，使凍存成本升高。而目前市面上常見的無血清細(xì)胞凍存液，會是對細(xì)胞最溫柔的替代選擇。

剛剛好的凍存方法：

上課快遲到時，嫌公交車速度太慢；送曖昧對象回家時，嫌走路速度太快。到底怎樣的降溫速度對細(xì)胞最好？經(jīng)研究證實：最佳降溫速度為 -1℃/分鐘；以下介紹三種常見凍存方法：

手動程序降溫：最傳統(tǒng)的降溫法，將細(xì)胞依序放在 4℃（30 分鐘）、-20℃（1 小時）、-80℃（過夜）；操作過程耗時久，容易做到一半就忘記。
程序冷凍儀：簡單來說就是特殊設(shè)計冷庫，內(nèi)建程序能準(zhǔn)確控溫，使細(xì)胞以每分鐘-1℃ 的速度降至-135℃。
程序降溫盒：一般最廣泛使用的降溫法，為一種特制冷凍容器（填充二甲基甲醇或依靠特制金屬導(dǎo)熱），使細(xì)胞以每分鐘約-1℃ 的速度降至-80℃。

快狠準(zhǔn)地叫醒細(xì)胞：

將凍存在-196℃ 液態(tài)氮中的細(xì)胞凍存管快速移至已 37℃ 預(yù)熱的水浴鍋中（水面需低于管口，避免水分意外進入凍存管），使細(xì)胞冷凍懸液迅速融化；此做法能讓細(xì)胞冷凍懸液快速通過-20℃～0℃ 這個結(jié)晶形成溫度范圍（圖 1），使凍存時細(xì)胞外的冰晶迅速融化，避免冰晶進入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對細(xì)胞造成二次傷害。細(xì)胞復(fù)蘇速度太慢，就會像艦長一樣「醒來卻一身病」，電影全程出現(xiàn)不到半小時就下去領(lǐng)盒飯啦！

最后祝各位穿越時空的細(xì)胞, 都能像電影主角一樣擁有美麗結(jié)局。

Reference

Fesenmaier K: Caltech Physicist Explains Why Snowflakes Are So Thin and Flat, 2011
CryopreservationGuide: The basics of cellular cryopreservation for research & clinicaluse., Biological Industries Israel Beit Haemek Ltd., 2017

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