DGGE 方法
瀏覽次數:149 發布日期:2020-3-2
來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE) 利用由堿基序列所決定的DNA片段溶解度或變性度的差異,達到分離野生型與突變型DNA片段的目的,該手段分辨率達一個堿基。當DNA 雙鏈沿變性劑濃度梯度增加的聚丙烯酰胺凝膠遷移時,DNA分子中解鏈溫度(Tm) 低的部分逐漸變性解鏈。一般總是錯配堿基部分的異源雙鏈Tm最低,最容易解鏈,其次是富含AT 堿基對的部位,富含GC堿基對的部位Tm值較高所以解鏈較難。因此,正常DNA雙鏈和異源雙鏈在梯度變性膠中電泳時,異源雙鏈總是先解鏈。
DGGE 方法需要設計特定片段最佳的PCR引物以及最佳變性條件,這一過程比較復雜,梯度變性膠的制備需要的設備較昂貴,所以在常規實驗室不易實施。
DGGE 的成功有賴于雙鏈DNA內部低溫解鏈部分變性后遷移率的改變。但在相當于最高Tm的變性劑濃度的位置,相應的DNA片段可能全部解鏈,使試驗無法檢出存在于高Tm DNA片段中的堿基替換。為了解決此問題,可以在一個PCR 引物的5 ' 端設計一段富含GC的尾巴,從而使PCR 擴增產物的一端富含GC 堿基對,保證了絕大多數DNA片段不會發生完全解鏈,在最高變性劑濃度區域仍然可以分辨出部分解鏈的異源雙鏈,這一改進使DGGE 的突變檢出率接近100%,但DGGE 只能檢測突變是否存在而不能確定突變的位置。