外泌體NfL，輕度創傷性腦損傷后遠隔癥狀的診斷性生物標記物？
導讀
持續輕度創傷性腦損傷（mTBI）是一種復雜的、異質性的損傷，其病理機制包括神經軸索損傷和血管損傷，并伴有強烈的炎癥反應。機械組織損傷后，受損細胞釋放外泌體到胞外空間。外泌體可以穿過血腦屏障，并可以從外周循環系統中分離出來，因此可以很容易地從外周循環中檢測其含量。外泌體所攜帶的物質可以使研究人員更加簡單方便地對中樞神經系統組織特異性的病理過程做出解析。
本研究通過對具有mTBI病史的退伍軍人進行研究，驗證了外周循環系統（外泌體和血漿）中候選TBI生物標記物（NfL、IL-6、IL-10、TNF-α和VEGF）與持續性神經行為癥狀之間的關系。
研究中使用Simoa HD-1分析儀，檢測NfL、IL-6、TNF-α、IL-10和VEGF在外泌體和血漿中的濃度水平并進行分析。Simoa HD-1分析儀是一款全自動數字式單分子免疫陣列檢測技術平臺，是基于其聲名顯赫的單分子免疫陣列技術（Simoa）開發的超靈敏的蛋白質檢測平臺，其檢測的平均靈敏度是傳統技術的1000倍。
發表期刊： Neurology；IF=8.689
原文鏈接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32461282/
研究背景
mTBI與損傷后數年內持續存在的或惡化的神經行為功能障礙有關。常見的創傷性腦損傷（TBI）臨床后遺癥和合并癥，例如腦震蕩后遺癥（PCS），創傷后應激障礙（PTSD）以及抑郁癥都有著明顯的癥狀重疊，并且在持續重復性TBI的患者中可能更嚴重。
本研究檢測了具有mTBI病史的退伍軍人的外周血和血漿中候選生物標記物的水平，并探討其與慢性癥狀的關系。采用Simoa技術檢測了神經絲輕鏈蛋白NfL、腫瘤壞死因子TNF-α、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）和血管內皮生長因子（VEGF）在外泌體和血漿中的濃度水平。比較了上述候選生物標記物與PCS、PTSD和抑郁癥狀之間的關系；以及無創傷性腦損傷（對照組）、1-2次mTBI患者和重復性（3次或更多）mTBI患者的生物標記物水平。
樣本
參與者被分為不同的TBI組進行分析，具體如下：（1）重復性（3次或更多）mTBI，（2）1-2 次TBI患者，和（3）對照組（無TBI史）。研究還比較了有或無爆炸暴露的受試者，以及伴有意識喪失/創傷性遺忘（LOC/PTA）的mTBI患者與只有意識改變（AOC）沒有LOC/PTA的mTBI患者之間的比較。
研究方法
01、PCS、PTSD和抑郁癥癥狀的評估
采用神經行為癥狀量表（NSI）評定PCS癥狀嚴重程度；使用創傷后應激障礙檢查表軍用版（PCL-M）評估PTSD的癥狀；抑郁癥狀采用9項患者健康問卷抑郁量表（PHQ-9）評估。
02、血樣收集和蛋白質檢測
生物標記物分析是在通過國際紅十字會（IRB）批準的方案下進行的。檢測血漿和從血漿中分離出的外泌體中的生物標志物水平。
03、從血漿中分離出外泌體
用ExoQuick法從含EDTA的冰凍血漿中分離出外泌體。
04、蛋白質定量
使用Simoa HD-1分析儀，檢測NfL、IL-6、TNF-α、IL-10和VEGF在外泌體和血漿中的濃度水平并進行分析。所有待檢物的濃度變異系數CV值（板內和板間）值均小于20%。
05、數據處理
本研究建立了包括人口統計學（年齡和性別）和臨床TBI特征（TBI的數量、最后一次TBI距今年限、第一次TBI距今年限、由爆炸引起的TBI歷史或相關的PTA或LOC癥狀）的廣義線性模型（GLMs），以評估PCS、PTSD和抑郁癥癥狀與生物標記物濃度水平之間的關系。
結論
01人口統計學和臨床特征
195名受試者的人口統計學和臨床特征如表1所示。與對照組相比，有TBI病史的個體表現出更嚴重的PCS、PTSD和抑郁癥狀。重復性TBI患者較僅有1或2次TBI的患者的PCS癥狀更為嚴重。重復性mTBI組患者中由爆炸引起的TBI的次數也顯著高于1-2次mTBI的患者組。重復性mTBI組中，首次TBI后距今的年限較長；在1-2次mTBI組中，最近一次TBI距今年限較短。
表1：人口統計學和臨床特征
02、重復性mTBI與生物標志物水平升高具有相關性
該研究比較了對照組、1-2次mTBI組和重復性mTBI組的生物標記物水平。觀察到外泌體NfL和血漿NfL存在顯著的組間差異。與對照組相比，1-2 次mTBI組和重復性mTBI組的外泌體和血漿NfL水平均升高。（表2）
03、TBI特征與生物標志物水平
TBI特征與生物標志物水平之間的相關性分析結果如圖2所示。mTBI次數與較高的外泌體和血漿NfL以及血漿IL-6濃度呈正相關。此外，首次TBI后的年數與較高的外泌體和血漿NfL、血漿TNF-α、血漿VEGF濃度呈正相關。同樣，自上次TBI以來的年數與外泌體NfL水平呈正相關。然而，IL-6水平隨著時間的推移而下降，自上次TBI以來的年數與IL-6水平呈負相關。自上一次TBI以來，血漿NfL和血漿VEGF之間的相關性略為顯著。
圖2. TBI特征與生物標志物水平的相關性
04、生物標記物水平與PCS、PTSD和抑郁癥狀的嚴重程度有關
TBI癥狀與生物標志物水平之間的相關性結果如圖3所示。NSI總分與外泌體NfL呈中度相關，與血漿NfL和血漿TNF-α輕度相關。研究還評估了每個NSI分量表（即軀體、情感、認知和前庭）與生物標記物水平之間的可能相關性。總的來說，外泌體NfL也與大多數NSI分量表呈中度相關。同樣，血漿NfL水平與NSI軀體、認知、前庭和有效子量表中的較高分數呈正相關。軀體和認知子量表的高分與血漿TNF-α濃度降低呈弱相關。
為了評估生物標記物水平與NSI、PCL-M和PHQ-9評分之間的相關性，利用校正后的人口統計學和臨床特征GLM模型（表3）進行分析。觀察到較高的NSI、PCL-M和PHQ-9評分與外泌體和血漿NfL水平的增加之間的關聯。
圖3. TBI癥狀與生物標志物水平的相關性
表3. 行為癥狀的廣義線性模型
小結
該研究結果表明，有mTBI病史的退伍軍人，尤其是重復性TBI，其候選生物標志物（NfL、IL-6、IL-10、TNF-α和VEGF）的活性發生改變，這與慢性神經和行為癥狀相關。具體來說，在有重復mTBI病史的患者中，NfL的外泌體和血漿水平較高；NfL是軸突損傷的神經標志物，反映了反復mTBI后的慢性、持續性軸突變性或遠端調節失調。外泌體和血漿中NfL水平的升高與PCS、PTSD和抑郁癥狀的嚴重程度相關；NfL水平的升高與首次損傷后的年數之間的相關性表明：軸突的持續和進行性調節失調可能是重復mTBI后慢性持續性癥狀綜合征的關鍵。
研究還發現炎癥標志物TNF-α和PCS和PTSD癥狀之間的相關性。本研究已經證明PTSD與外周血炎癥細胞因子的升高有關，還表明慢性，特別是重復性mTBI與PTSD之間存在聯系。這些發現有助于建立慢性mTBI持續性神經行為癥狀的預后生物標志物，并闡明mTBI后常見癥狀復合物的潛在機制。研究發現持續升高的神經和神經炎癥標志物，包括mTBI總量和不斷增加的癥狀負擔之間的劑量依賴關系，可能為反復mTBI后持續癥狀發展的潛在發病機制提供了線索。
該項研究證明了這些容易獲得的生物標記作物具有作為mTBI退伍軍人行為改變的預測因子的潛力，并為潛在的病理機制提供了見解。
外泌體檢測怎么可以沒有Simoa？
近年外泌體研究熱情持續高漲，外泌體最吸引人的是它能穿梭于細胞間，作為細胞間交互的橋梁。縱觀國家自然科學基金外泌體資助細分領域，發現近年來資助較多的是外泌體中核酸水平的研究，如miRNA，lncRNA和circRNA等，這可能與核酸研究的技術比較成熟有關。然而，蛋白作為最終表達產物，外泌體蛋白研究領域也必將成為外泌體研究不可或缺的部分。以前，由于體液、細胞上清中含有外泌體的量很低，利用傳統的Western Blot、ELISA等方法滿足不了低豐度蛋白的檢測。現在，創新性的Simoa平臺的出現彌補了檢測技術的不足，將極大推動外泌體中蛋白成分的研究。
針對外泌體研究，SBC開發了一套完整的外泌體研究技術服務體系，提供從外泌體收集、鑒定到外泌體中核酸/蛋白提取、高通量篩選、生物信息數據分析、目的核酸/蛋白驗證等技術服務項目。
