如何用正確的方法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)？

很多小伙伴們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)過程中會(huì)有這樣的疑問，“我計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)量準(zhǔn)確嗎？”今天我們就來聊一聊如何進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

在進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)之前，我們先來了解一下血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的構(gòu)造。
 

血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的構(gòu)造

血細(xì)胞計(jì)數(shù)板是由一塊比普通載玻片厚的特制玻片制成的。玻片中有4條下凹的槽，槽與槽之間構(gòu)成3個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)較寬，其中間又被一短橫槽隔為兩半，每半靠近橫槽一邊上面刻有一個(gè)方格網(wǎng)。方格網(wǎng)上刻有9個(gè)大方格（見圖1C），其中只有中間的一個(gè)大方格為計(jì)數(shù)室，供細(xì)胞計(jì)數(shù)用。計(jì)數(shù)室通常有兩種規(guī)格：一種是大方格內(nèi)分為25個(gè)中方格（中方格之間用雙線分開，見圖1D），每一中方格又分為16 個(gè)小方格；另一種是大方格內(nèi)分為16個(gè)中方格，每一中方格又分為25個(gè)小方格。不管計(jì)數(shù)室是哪一種構(gòu)造，它們都有一個(gè)共同的特點(diǎn)，即每一大方格都是由16×25=400個(gè)小方格組成（見圖1D）。

圖1. 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的構(gòu)造

注：計(jì)數(shù)室邊長(zhǎng)為1 mm，面積為1 mm² ，每個(gè)小方格的面積為1/400 mm²。蓋上蓋玻片后，計(jì)數(shù)室的高度為0.1 mm，所以其體積為0.1 mm³ ，每個(gè)小方格的體積為1/4000 mm³。
 

01實(shí)驗(yàn)材料

無 菌：DPBS、0.25%胰蛋白酶、吸管、完全培養(yǎng)基。

非無菌：移液器、20 μl或100 μl 可調(diào)式、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、95%乙醇溶液或無水乙醇、0.4% 臺(tái)盼藍(lán)溶液（BI貨號(hào)：03-102-1B）、數(shù)字計(jì)數(shù)器、普通顯微鏡。

 

02實(shí)驗(yàn)原理

在細(xì)胞培養(yǎng)工作中，常需要了解細(xì)胞生活狀態(tài)和鑒別細(xì)胞是否存活，確定細(xì)胞接種濃度和數(shù)量以及了解細(xì)胞活力和增殖狀況，如胰酶消化制備的細(xì)胞懸液中細(xì)胞存活率確定，凍存細(xì)胞復(fù)蘇后的活力檢測(cè)等。

存活測(cè)試的原理為染料排除實(shí)驗(yàn)，利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色，因活細(xì)胞細(xì)胞膜完整，染料無法滲入而不會(huì)呈色。一般使用臺(tái)盼藍(lán)染料，如果細(xì)胞不易吸收臺(tái)盼藍(lán)，則用赤蘚紅B。計(jì)算細(xì)胞活率：活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）×100%。計(jì)數(shù)應(yīng)在臺(tái)盼藍(lán)染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成，隨時(shí)間延長(zhǎng)，部分活細(xì)胞也開始攝取染料；因?yàn)榕_(tái)盼藍(lán)與蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確。

 

03實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法

1. 制備動(dòng)物細(xì)胞懸液

細(xì)胞懸液制備方法是用DPBS液洗滌、0.25%的胰蛋白酶消化后，加入完全培養(yǎng)基（或Hanks液，PBS或DPBS等平衡鹽溶液），輕輕吹打混勻，制成待測(cè)細(xì)胞懸液。

2. 細(xì)胞計(jì)數(shù)

• 計(jì)數(shù)板處理

  在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。將清潔干凈的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室上加蓋專用蓋玻片。

• 染色

  用滴管吸取0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液（BI貨號(hào)：03-102-1B），按1∶1比例加入細(xì)胞懸液中，輕輕吹打混勻。將細(xì)胞懸液滴于蓋玻片邊緣，使之充滿計(jì)數(shù)板和蓋片之間的空隙中。注意不要使液體流到旁邊的凹槽中或帶有氣泡，否則要重做。稍候片刻，將計(jì)數(shù)板放在低倍鏡下（10×10倍）觀察計(jì)數(shù)。

• 計(jì)數(shù)方法

  按圖計(jì)算計(jì)數(shù)板的四角大方格（每個(gè)大方格又分16個(gè)小方格）內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)，只計(jì)數(shù)完整的細(xì)胞，若聚成一團(tuán)的細(xì)胞則按一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。在一個(gè)大方格中，如果有細(xì)胞位于線上，一般計(jì)上線細(xì)胞不計(jì)下線細(xì)胞，計(jì)左線細(xì)胞不計(jì)右線細(xì)胞。兩次重復(fù)計(jì)數(shù)誤差不應(yīng)超過±5%。鏡下觀察，凡折光性強(qiáng)而不著色者為活細(xì)胞，染上藍(lán)色者為死細(xì)胞。

• 計(jì)數(shù)換算

  計(jì)完數(shù)后，需換算出每毫升懸液中的細(xì)胞數(shù)。由于計(jì)數(shù)板中每一方格的面積為 0.01 cm²，高為 0.01 cm，這樣它的體積為0.0001 cm³，即0.1 mm³=1×10⁴ ml，所以每一大方格內(nèi)細(xì)胞數(shù)×10⁴=細(xì)胞數(shù)/ml，故可按下式計(jì)算：細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù) /mL = （四個(gè)大格細(xì)胞總數(shù) /4）×2×10⁴。公式中乘以2，是因?yàn)榧?xì)胞懸液于臺(tái)盼藍(lán)染液是1：1稀釋。如計(jì)數(shù)前已稀釋，可再乘稀釋倍數(shù)。計(jì)數(shù)細(xì)胞后，計(jì)算細(xì)胞懸液濃度并求出存活與死亡細(xì)胞數(shù)的比例。

• 示例
  T75 單層培養(yǎng)，制成10 ml細(xì)胞懸浮液，取0.1 ml溶液與0.1 ml 臺(tái)盼藍(lán)混合均勻于離心管中，取少許混合液加入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，計(jì)數(shù)四大方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目。

• 活細(xì)胞數(shù)/方格：55，62，56，60；死細(xì)胞數(shù)/方格：5，3，4，6；細(xì)胞總數(shù)=251

• 平均細(xì)胞數(shù)/方格=62.75；稀釋倍數(shù)=2；
  細(xì)胞數(shù)/ml：62.75×10⁴×2（稀釋倍數(shù)）=1.26×10⁶；
  細(xì)胞數(shù)/flask（10 ml）：1.26×10⁶×10 ml=1.26×10⁷

• 存活率：233/251﹦92.8%

注意事項(xiàng) 

• 滴細(xì)胞懸液時(shí)要干凈利落，加量要適當(dāng)，過多易使蓋片漂移，或淹過蓋片也會(huì)失敗，應(yīng)重做；過少易出現(xiàn)氣泡；不理想時(shí)，應(yīng)重做。

• 鏡下計(jì)數(shù)時(shí)，若方格中細(xì)胞分布明顯不均勻，說明細(xì)胞懸液混合不均勻，需重新將細(xì)胞懸液進(jìn)行混合，再重新計(jì)數(shù)。

• 計(jì)數(shù)時(shí)，對(duì)于位于邊線或交界處的細(xì)胞/細(xì)胞團(tuán)，遵循“計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右”的規(guī)則。

• 一個(gè)細(xì)胞團(tuán)計(jì)做一個(gè)細(xì)胞。

• 計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，最適濃度為5～10×10⁵細(xì)胞/ml，此范圍外計(jì)數(shù)誤差偏大。高濃度細(xì)胞懸液，可取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計(jì)數(shù)。如果細(xì)胞數(shù)目很少則要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中。

圖2. 細(xì)胞計(jì)數(shù)示意圖（圖源網(wǎng)絡(luò)）

 

血細(xì)胞計(jì)數(shù)板使用后，用自來水沖洗，切勿用硬物洗刷，洗刷后自行晾干或者用吹風(fēng)機(jī)吹干，或用95%乙醇，無水乙醇等有機(jī)溶劑脫水使其干燥。通過鏡檢觀察每小格內(nèi)是否殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)清洗，直到干凈為止。

 

1. 人工失誤（混勻、加樣、稀釋、計(jì)算錯(cuò)誤以及人工操作誤差）。

2. 多次計(jì)數(shù)以保證結(jié)果準(zhǔn)確的必要性。

3. 細(xì)胞均勻分布的要求。

4. 儀器及材料差異（柵格，深度，蓋玻片，緩沖液類型以及移液器）。

血細(xì)胞計(jì)數(shù)板幾百年來在生物醫(yī)學(xué)研究中一直都是一個(gè)必備的工具，并且經(jīng)歷了很多的改進(jìn)才形成了今天研究者們使用的樣子，但還是會(huì)有很多不可避免的計(jì)數(shù)誤差。

如今，現(xiàn)代化自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的使用已經(jīng)很大程度上消除了許多引起誤差的情況，提高了細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性和效率。

目前，市面上也有多種品牌的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，有基于細(xì)胞圖像的，也有基于Coulter原理的，但是主要目的就是將實(shí)驗(yàn)人員從繁冗無聊的手工計(jì)數(shù)中解放出來，排除操作者的主觀性。

 

如何選擇推薦細(xì)胞計(jì)數(shù)儀

1. 要考慮細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的性價(jià)比：如果您的目的只是代替手工計(jì)數(shù)，節(jié)省操作者的時(shí)間，操作簡(jiǎn)便，則完全沒有必要花費(fèi)較多的經(jīng)費(fèi)買一臺(tái)僅能進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)的儀器，花大錢辦小事。

2. 要考慮細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的穩(wěn)定性和重復(fù)性：如果您對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性要求高，那儀器的高性能和穩(wěn)定性是首要考慮因素，還要考慮儀器的硬件以及配套軟件的穩(wěn)定性，不能一味的追求低價(jià)格。

3. 要考慮根據(jù)細(xì)胞類型選擇適合的型號(hào)：如果您的樣本是原代細(xì)胞，背景復(fù)雜，紅細(xì)胞和血小板污染嚴(yán)重，您又希望快速精確計(jì)數(shù)有核細(xì)胞且進(jìn)行精確細(xì)胞活力分析，計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成功和重現(xiàn)性。那么雙熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)&活力分析儀將是幫您解決問題的有力裝備。

4. 要考慮實(shí)驗(yàn)室多功能檢測(cè)需求：如果細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力分析只是實(shí)驗(yàn)室的部分需求，而實(shí)驗(yàn)室還要進(jìn)行凋亡、細(xì)胞周期、GFP等功能檢測(cè)，且實(shí)驗(yàn)室也無配套的儀器，那為實(shí)驗(yàn)室裝備一款多功能的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀是您的最佳之選，省時(shí)，省力可以輕松、簡(jiǎn)單、隨時(shí)親自操作獲得理想結(jié)果。

大家可以根據(jù)自己的實(shí)際情況進(jìn)行比對(duì)選購(gòu)哦！

References

1. 沈萍, 范秀容, 李廣武. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 第3版. 北京: 高等教育出版社, 1999: 90～92.

2. 李洪臣, 楊秀艷. 使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板測(cè)定微生物數(shù)量實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)[ J ]. 生物學(xué)通報(bào), 2007, 42 (7) : 22.