如何學習從細胞狀態判斷與避免污染
一、為什么要了解細胞形態
定期檢查培養細胞的形態（即形狀和外觀）對于取得細胞培養實驗成功至關重要。每次用眼睛和顯微鏡檢查細胞，除了確認細胞的健康狀況，我們還可以及早發現任何污染的跡象，避免污染擴散至實驗室其他細胞。
二、細胞形態變化的跡象
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細胞核旁顆粒的堆積
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細胞質中有空泡
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細胞團縮并從平板上脫離
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外形變化
三、細胞形態變化原因
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培養基改變
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細胞污染
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細胞老化
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有毒物質
四、哺乳動物細胞形態
大多數培養的哺乳動物細胞根據其形態可分為四大類。
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成纖維細胞（或成纖維細胞樣）：細胞是雙極或多極的，狹長型，貼壁細胞；
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上皮細胞呈多角形，尺寸更為規則，貼附在基質上呈散斑片狀生長；
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淋巴細胞，呈球形，通常懸浮生長，不貼附在基質表面；
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神經元細胞體（貼壁細胞）。
神經元有多種形狀和大小，可以粗略地劃分為兩個基本形態類別。I型具有很長的軸突，可長距離傳遞信號，II型則沒有軸突。典型的神經元會從胞體部發出具有許多分支的細胞伸展結構，因此被稱為樹突樹。神經元可以是單極或假單極細胞，即：樹突和軸突發自同一突起，可以是雙極細胞，即：軸突和單個樹突發自胞體（有核細胞的中心部分）上相對的兩端，也可以是多極細胞，即：細胞具有兩個以上的樹突。
五、細胞污染
1. 細菌污染
常見的細菌污染有枯草桿菌（Bacillus Subtilis）、大腸桿菌（Escherichia Coli）、假單胞菌（Pseudomonas）、白色葡萄球菌（Staphylococcus Albus）等，其中革蘭氏陽性菌較為多見。
圖片來源：Bing
細菌污染會導致培養基1~2d出現黃色或白色渾濁、顏色改變以及pH值急劇變化，受污染的貼壁細胞在幾天內會逐漸脫壁死亡；有些狀況下培養基顏色改變不明顯但細胞形態會變異（出現多角，多核）；顯微鏡觀察培養液中有大量圓球形顆粒物漂浮，呈細沙狀。
主要來源：
操作不當或器材消毒不嚴；細胞培養試劑污染細菌未被檢測出來。
解決辦法：
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2. 真菌污染
常見的真菌污染為煙曲霉，黑曲霉，毛霉菌，孢子霉，白色念珠菌，酵母菌等。
圖片來源：Bing
真菌污染后短期內不會出現培養液的渾濁，培養基中會漂浮白色、淺黃色或黑色的小點，4d左右可以在高倍鏡下觀察到絲狀，管狀或者串珠狀的菌絲。有些真菌開始很像死細胞碎片，但是與之不同的是，它有很多很多的小塊，很清楚，像珊瑚狀，不像死細胞碎片分不清。酵母菌污染，顯微鏡下常見成串的珠狀物，形態呈卵形，大約比細胞小5~10倍。當其進行出芽生殖時，會聚集成連體結構。
圖片來源：Bing
主要來源：
實驗人員（實驗服），并且具有季節性，像長蘑菇的季節很容易感染這種菌類。
解決辦法：
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3. 支原體污染
支原體是一種大小介于細菌和病毒之間（直徑0.15 μm~0.2 μm）并獨立生活的微生物，所以能透過一般的細胞培養過濾方法，0.22 μm的過濾膜。支原體無細胞壁，形態呈高度多形性。可為圓形、絲狀或梨形。支原體形態多變，在光學顯微鏡下不易看清內部結構。
圖片來源：Bing
細胞培養（特別是傳代細胞）被支原體污染是個世界性問題。在細胞培養中支原體感染發生率達到63%。支原體早期污染，培養液也不渾濁。后期污染會出現培養基變色、細胞生長受抑、細胞成團、鏡下有小顆粒甚至死亡。研究表明，支原體能耗盡營養物，促進代謝積累，導致pH改變，對細胞造成多種影響，包括生長狀況、生化特性、代謝、免疫、以及細胞存活等多方面的改變，繼而干擾實驗結果，或造成無法解釋的差異。
支原體污染的來源：
工作環境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養基的污染、污染支原體的細胞造成交叉污染、實驗器材帶來的污染和用來制備細胞的原始組織或器官的污染。
解決辦法：
逍鵬生物可提供：支原體檢測/處理/預防全套解決方案。
1. 即用型細胞培養中支原體檢測PCR試劑盒
2. 支原體處理試劑
3. 支原體預防噴霧
支原體檢測/處理/預防全套解決方案：
4. 病毒污染：
病毒感染可能來自宿主動物細胞或病人，病毒感染及傳播具有細胞專一性，在細胞培養污染物中是相對較難檢測的。然而一旦細胞遭受污染后顯微鏡下能明顯觀察到細胞碎片增多、腫大、圓縮、脫落等病態變形，嚴重時會在單層細胞上觀察到局部破損空斑。
污染來源：
可能來源于血清，胰酶及其他動物源試劑。如BSA，HSA等。
解決辦法：
逍鵬生物提供的解決方案：選用輻照血清以殺滅病毒。
5. 黑膠蟲污染
目前科學界對黑膠蟲并無定論，認為是不明沉淀現象或多種未知生物污染現象的通稱。Dr.Cell 目前檢測的黑膠蟲樣本，62%為細菌，38%為支原體。
在顯微鏡的高倍鏡下可見培養液中有小黑點狀顆粒（卵圓狀、球狀、桿狀等），并做活躍的布朗運動或原地顫動，即可大致判斷為黑膠蟲污染。黑膠蟲比細胞體積小很多，主要分布在細胞間隙。黑膠蟲污染前期細胞無明顯變化，培養液中有少許做布朗運動的小黑點，污染后期小黑點會迅速增殖導致細胞出現裂解死亡。細胞勤換液可以稍微緩解黑膠蟲增殖速度，但無法擺脫污染。
污染主要來源：
因為目前科學界對于黑膠蟲并無準確定論，因此主要來源也無法進行斷論。根據Dr.Cell檢測的黑膠蟲樣本可以看出，黑膠蟲的來源是多樣性的，試劑，耗材，人為等都有可能。
解決辦法：
逍鵬生物可提供以下解決方案：
使用三抗（貨號：03-032-1B）結合支原體處理試劑（貨號：03-036和03-037或03-038）有效清除實驗室黑膠蟲污染。
6. 細胞交叉污染和錯誤辨識
做實驗遭遇細胞系污染的心情無異于得知追了很久的女神（男神）已經有了另一半。更糟糕的是，這兩件事情發生的概率都比想象的高。
HeLa 細胞，堪稱細胞界的“隔壁老王”。目前，世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染，致使許多實驗宣告無效。據統計約30%細胞系被交叉污染或錯誤辨識。Science雜志2014年12月發表了一篇題為“Cell Biology. Fixing problems with cell lines”的專題文章闡述細胞交叉污染和錯誤辨識，2個月后Science一篇題為“Line of attack”文章描述在學術界中培養的細胞發生交叉污染或被錯誤辨識的嚴重性。2015年4月Nature通知：Nature旗下雜志將從5月開始要求作者鑒定論文中所用細胞系。
細胞株的交叉污染，常因不經意的實驗疏忽（不同細胞株分盤時，共享一瓶培養基；槍頭、移液管忘記更換，而造成不同細胞株之間的混合污染；實驗操作人員錄入錯誤細胞株名稱；傳代時的培養皿；冷凍細胞時的凍存管）而發生，繼而造成后續數據搜集錯誤。
主要原因：
標記錯誤和細胞間的交叉污染。
解決辦法：
Dr.Cell可提供：（點擊名稱鏈接可進入詳情頁）
1. 人源細胞系STR鑒定（STR Authentication）
2. 細胞物種鑒定（Species Identification）-15種常見種屬的物種鑒定
掌握好這些細胞污染的鑒別，找到導致自己細胞狀態不好的“元兇”，相信您培養的細胞一定越來越好！
REFERENCES
【1】Morozkin ES, Sil Nikov VN, Rykova EY, Vlassov VV, LaktionovPP. Extracellular DNA in culture of primary and transformed cells, infected and not infected with mycoplasma. Bull Exp BiolMed 2009; 147(1): 63-5.
【2】Kenny GE. CHAPTER 5-contamination of mammalian cells in culture by mycoplasmata. Contamination in Tissue Culture 1973;49(10): 107-29.
【3】 Rottem S, Barile MF. Beware of mycoplasmas. Trends Biotechnol 1993; 11(4): 143-51.
【4】陳琳, 陳鯉群. 細胞污染及檢測鑒定[J]. 中國細胞生物學學報, 2017(04):496-503.
【5】http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0170384#pone-0170384-t001
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