實例講解：外周單個核細胞（PBMC）的計數方法
從供體中收集全血，分離并保存PBMC，同時保留剩余的血細胞和成分返回到主體（單采血液成分法）1。該過程產生大量的PBMC，其適合于進一步的實驗或研究。
PBMC的計數
PMBC的大小小于許多哺乳動物細胞類型，并且取決于樣本，可能包含紅細胞（紅細胞，RBC）污染。建議在通過康寧細胞計數器計數之前，通過離心分離或裂解去除RBC。
PMBC通常使用費時的手動方法（例如血球計數器）進行計數。自18世紀2以來，血細胞計數儀一直被認為是進行細胞計數的金標準，但結果通常是主觀的，易變的，并且細胞直徑的細微差異無法輕易或可重復地產生被察覺。
康寧細胞計數器提供了另一種方法，可以快速，準確地對這些細胞進行計數。開發了計數算法以識別和清除碎片并解決死細胞的問題，同時該應用程序的功能允許對種群進行門控，以從最終計數中清除較大的細胞和碎片。
材料和方法
使用康寧細胞計數器和使用血細胞計數器進行手動計數在兩個不同的天對來自兩個供體（所有細胞；阿拉米達，加利福尼亞）的冷凍保存的PBMC（無RBC）進行計數。
在康寧細胞計數器上對細胞進行計數，然后立即進行手動計數，并使用血細胞計數器和錐蟲藍排除法確定細胞活力。計數區域（1.96毫米2）的代表性圖像如（圖1）所示。
使用了康寧單元計數器的多計數功能（作為一個計數的一部分，最多可以采樣八個字段）。在這個實驗中，使用康寧細胞計數器對每個計數采樣了八個不同的區域（總面積= 15.68 mm2），而手動方法對血細胞計數器的五個大正方形進行了計數（總面積= 5 mm2）。
圖1.調焦后和計數后的代表性康寧細胞計數器圖像。
（A）計數前正確聚焦圖像。（B）計數結果。活細胞（綠色圓圈）；死細胞（紅色圓圈）。通過算法和用戶指定細胞大小的門控，可以排除小細胞和碎片的計數（圖2中的示例）。
（C）面板（B）的放大圖。
圖2.
（A）直方圖顯示了澆口直徑設置為5至16 µm。超出此閾值的單元格從計數中排除。可以切換死細胞（紅色條）和活細胞（綠色條）以獨立檢查那些亞群。顯示了一個樣品中八個計數的平均值±SD；如所述使用多計數功能。（B）可通過使用多計數功能獲得擴展的數據。
結果和討論
使用CytoSMART™應用程序或CytoSMART云中結果頁面的直方圖功能，門控設置為5至16 µm（圖2）。對于此評估期間生成的實驗數據，（圖3）和（圖4）顯示了兩個供體在10個獨立樣本中的結果。
當使用配對t檢驗比較兩種計數方法時，細胞密度和活力百分比的p值均大于0.05，表明每個數據集之間均無統計學差異。這些結果表明康寧®細胞計數器適合由經過培訓的操作員對PMBC進行精確計數。
對PBMC進行計數時，重要的是避免計數不是細胞的死細胞。要在康寧細胞計數儀上計數為死細胞，該細胞在所有字段中必須顯示為暗色，如（圖5）所示。另外，還要注意計數的樣品中不存在RBC，因為這可能會降低計數的準確性。
圖3.通過計數方法得出的細胞密度（圖表以供體分隔）。聯合供體的配對t檢驗p = 0.141。
圖4.通過計數方法得出的細胞活力（圖表以供體分隔）。聯合供體的配對t檢驗p = 0.718。
圖5.活細胞與死細胞聚焦圖像
結論
康寧細胞計數器可用于需要精確細胞計數的PBMC計數中，并用作血細胞計數器手動計數的替代方法。
盡管康寧細胞計數器非常易于使用，但需要觀察到適當的聚焦技術，以避免來自不同用戶的計數的主觀性。每一次計算，用戶都將獲得經驗和熟練程度，從而提高準確性。
與通過手動方式相比，可以在康寧細胞計數器上對密度更高的細胞懸浮液進行計數。因此，將更準確地表示整個細胞群體，并且完全避免了“咔噠聲疲勞”的相關問題。
與手動計數相比，使用多計數功能是對較大區域進行計數的一種快速簡便的技術。
康寧細胞計數儀
Corning細胞計數儀可在三秒內完成單次細胞計數*，相較大多數的自動細胞計數儀更快。傳統的細胞計數是基于圖像分析算法在一個相對較小的計算平臺上完成。而 Corning細胞計數儀則采用CytoSMART™云計算應用軟件，通過MicrosoftAzure云端計算平臺進行圖像處理。這種云計算系統意味著更快更準確的圖像分析能力。
準確率高
Corning細胞計數儀使用先進的圖像分析處理軟件，應用復雜的深度神經網絡算法，使細胞計數的準確性達到最大。若添加臺盼藍，儀器便可在計數時區分活細胞和死細胞，從而計算出細胞活力。同時該軟件還能對含有細胞簇的樣本進行分析處理，所以對高濃度的細胞樣本（高達1 x 10 7 個細胞/ mL）Corning細胞計數儀亦能進行精確計數。
計數成本低
每臺Corning細胞計數儀會提供一片可重復使用的細胞計數板，很大程度的節約了客戶一次性耗材的投入成本。同時客戶也可使用相應的血球計數板結合Corning細胞計數儀進行細胞計數。
操作簡便
Corning細胞計數儀操作十分簡便，無需花費過多的時間進行人員操作培訓。首先，將儀器連接到您的計算機或平板電腦，啟動CytoSMART™云應用程序。然后，將裝有樣本的細胞計數板放置在儀器上，調整焦距，點擊“計數”按鈕，即可進行細胞計數，可對8次計數結果進行同步分析。
隨時隨地查看數據
傳統自動細胞計數儀瓶頸：
◗ 機載的計算機系能較小，報告生成時間過長。
◗ 屏幕分辨率低，不能很好的分辨出活細胞或死細胞。
◗ 只能通過U盤將數據導出。
Corning細胞計數儀很好的解決了以上難題。Corning細胞計數儀可在計算機上快速生成測試報告，包含計數樣本的細胞濃度和活力，以及標注活細胞和死細胞的樣本圖像（若計數時添加臺盼藍），并將報告發送至CytoSMART™云端，使您可以隨時隨地在智能手機，平板電腦或計算機上查閱生成的圖像和計數結果。所有測試生成的報告都將保存在CytoSMART™云端，因此您可以調閱相聯實驗的報告分析細胞培養的狀態和質量。
參考文獻
1.https://www.allcells.com/tissue-products/leukopak/
2. Lin-Gibson S, et al. Summary of the National Institute of Standards and Technology and US Food and Drug Administration cell counting workshop: Sharing practices in cell counting measurements Cytotherapy, 2018; 20:785-795.
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匿名 (123.14.97.112)
conning細胞計數儀是在顯微鏡下顯示細胞，計數的是視野內的細胞。顯微鏡下視野大小隨放大倍數和聚焦距離變化。計數區域面積1.96毫米2是怎么確定的？真實性，準確度多大，有參照標準嗎？請通過郵箱回復。
2022-2-25 10:31:00
conning細胞計數儀是在顯微鏡下顯示細胞，計數的是視野內的細胞。顯微鏡下視野大小隨放大倍數和聚焦距離變化。計數區域面積1.96毫米2是怎么確定的？真實性，準確度多大，有參照標準嗎？請通過郵箱回復。
2022-2-25 10:31:00
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