前段時間我們了解了全能“女神”MSC，那么今天我們將了解，如何進行培養，培養的過程中需要注意哪些事項？

接下來跟隨我們一起做實驗吧~

實驗目的

利用間充質干細胞無血清培養基培養分離臍帶間充質干細胞。

實驗材料

新生兒臍帶

實驗主要儀器

醫用手術器械，生物安全柜，CO₂培養箱，6孔培養板，T25培養瓶

實驗試劑

表.  MSC NutriStem^®XF Medium

用途	品牌	貨號	名稱	規格	保存條件
MSC培養基	BI	05-200-1A	MSC  NutriStem® XF Basal Medium MSC無血清基礎培養基	500ml	4℃
	BI	05-201-1U	MSC  NutriStem® XF Supplement MSC無血清添加劑	3ml	-20℃
細胞貼壁	BI	05-752-1H	MSC  Attachment solution (100X) MSC貼壁試劑	1 ml	4℃
	BI	05-760-1-15	NutriCoat™  Attachment solution (500X)  NutriCoat™貼壁試劑	1.5 ml	RT
	BI	PLTGOLD010R	PLTGold®  Human Platelet Lysate 血小板裂解物**	10ml	-20℃
	**已知血小板裂解物含有大量的外泌體，用戶可依照實驗目的選用合適的貼壁試劑。
細胞傳代	BI	03-079-1A	Recombinant  Trypsin-EDTA Solution 重組胰酶-EDTA	500ml	RT
	BI	03-048-1C	Soybean  Trypsin Inhibitor (50X) 大豆胰酶抑制劑	20 ml	-20℃
	BI	02-023-1A	DPBS (w/o  Ca & Mg)	500 ml	RT
			DPBS緩沖液
輔助試劑	BI	05-713-1B	NutriFreez®  D10 Cryopreservation Medium	100 ml	4℃
			NutriFreez®  D10無血清凍存液
	BI	03-031-1B	Penicillin-Streptomycin  Solution (100X)青鏈雙抗	100ml	-20℃
	VC	C3501-0100	MSC ACF  Tissue Digestive Mix 高效原代干細胞分離液	100ml	-20℃

實驗前準備

1. 凍存的MSC NutriStem^® XF Supplement在室溫或2-8℃解凍，避免反復凍融。

2. 配制：MSC NutriStem^® XF Basal Medium（培養基）：MSC NutriStem^® XF Supplement（添加物）：青鏈雙抗=500ml：3ml：5ml，4℃保存，2周內使用。

注1：雙抗非必須，建議原代（P0）時使用。

注2：培養基含L-Glutamine，貯藏時避免長期照光。

包被培養皿

或跳過此步驟，直接加2%血小板裂解物，促進MSC細胞貼壁與生長。

如果使用05-752-1H，參考如下步驟：

1. 使用DPBS溶液（BI，Cat：02-023-1A），將MSC貼壁試劑稀釋100倍（1:100）。

2. 參照下表，加入適量的1X MSC貼壁試劑涂層培養皿或板。

表. 涂層過程中貼壁試劑建議使用量（05-752-1）

培養器皿	表面積cm2/孔或瓶	1X MSC貼壁試劑使用體積
96孔板	0.34	0.05~0.1 ml
24孔板	1.9	0.2~0.4 ml
12孔板	3.9	0.4~0.8 ml
6孔板/ 35 cm培養皿	9.6	1~2 ml
T25瓶/ 60 cm培養皿	25	2.5~5 ml
T75瓶	75	7.5~15 ml

注1：涂層的培養皿需在無菌條件下2℃-8℃儲存，需在一周內使用。（標示紅色為原廠建議使用量，經過實驗測試后可減半使用。）

3. 輕輕搖動培養皿，確認貼壁試劑均勻分布在培養皿表面后，用封口膜包裹涂層的培養皿。

4. 在2-8℃孵育過夜；或者在CO₂培養箱，37℃，至少孵育30分鐘。

5. 接種前, 吸除貼壁試劑，再用DPBS輕輕沖洗培養皿，即可接種細胞。

如果使用05-760-1-15，參考如下步驟：

1. 使用生理鹽水，將NutriCoat™ 促貼壁試劑稀釋500倍（1:500）。

2. 參照下表，加入適量的1X NutriCoat™ 促貼壁試劑涂層培養皿或板。

表.  涂層過程中貼壁試劑建議使用量（05-760-1-15）

培養器皿	表面積cm2/孔或瓶	1X NutriCoat™ 促貼壁試劑使用體積
96孔板	0.34	0.1 ml
24孔板	1.9	0.5 ml
12孔板	3.9	1 ml
6孔板	9.6	2.5 ml
T25瓶	25	6.5 ml
T75瓶	75	19 ml

注1：涂層的培養皿需在無菌條件下2℃-8℃儲存，需在一周內使用。

注2：包被期間，注意包被液不可以干掉！

3. 輕輕搖動培養皿，確認貼壁試劑均勻分布在培養皿表面后，用封口膜包裹涂層的培養皿。

4. 在2-8℃孵育過夜；或者在CO₂培養箱，37℃，至少孵育1小時。

5. 接種前, 吸除貼壁試劑，用DPBS輕輕沖洗培養皿（或不需要清洗），即可接種細胞。

制備1X大豆胰酶抑制劑

使用無菌的DPBS，將50X大豆胰酶抑制劑（BI，Cat：03-048-1C）稀釋成1X。

注1：抑制重組胰酶消化建議方法：

第一種使用大豆胰酶抑制劑；

第二種使用PBS/DPBS清洗（2倍重組胰酶量）吹打, 離心去上清；第三種使用維持培養基抑制。

無血清培養基抑制胰酶效果較差，使用無血清培養基時建議用第一或者第二種方法抑制/清除胰酶。

UC-MSC原代培養（組織塊法）

1. 無菌條件下取新鮮臍帶，用DPBS漂洗凈血跡。

注1：一般臍帶取得非無菌環境，可以稍微用75%酒精潤洗。

2. 置10 cm于培養皿中，剪成1~2cm臍段，剔除血管，用DPBS洗凈血跡，再剪成1 mm³組織塊。(圖1)

3. 用無菌滴管吸取少量細小組織塊均勻散布在 6 孔板 2 個孔中。

4. 37℃，5%CO₂培養箱孵育30min，以使組織塊粘貼在培養皿壁上。

5. 向每孔滴加0.8 ml 完全培養基（注意沿孔壁小心滴加，勿使沖動組織塊） 。

6. 37℃，5% CO₂ 培養箱孵育過夜，次日（D1）每孔再補加1 ml 完全培養基。

7. 37℃，5% CO₂ 繼續培養，5天（D6）后半量換液（此時一般看不到細胞，但最快3天就可看到細胞從組織邊沿爬出）。

8. 再過5天后半量換液（此時一般會有細胞爬出，但最晚可到14天會出現細胞從組織邊沿爬出）(圖2、圖3)。

9. 每2天換一次培養液，繼續培養2~4天，待細胞融度（Confluency）達到約80%后傳代培養（圖4）。

注1：組織塊培養的關鍵是要保障組織塊始終貼壁，換液動作要盡可能輕微，避免沖動組織塊。培養基加量不能太多，以免組織塊漂浮。

圖1. 剔除臍帶3根動靜脈血管

圖2. 細胞從組織塊邊沿爬出

圖3. 細胞快速增殖

​​​​​​​圖4. 傳代時機成熟

UC-MSC原代培養 （消化法）

MSC NutriStem^®無血清培養基能有效地培養消化法獲得原代細胞，操做方式參考如下：

1. 將臍帶用DPBS（BI，Cat：02-023-1A）+1%青鏈雙抗（BI，Cat：03-031-1B）漂洗3~5次，剪成 1-2 cm大小，剔除兩根動脈血管和一根靜脈血管，獲得華通氏膠，同時稱重。

2. 將組織塊剪成 3-5 mm³，移入50 ml 離心管，再加入相應比例的分離液（VC，Cat：C3501-0100）。

3. 組織塊（華通氏膠g）: （分離液vol）= 1:3（1g:3ml），在分離液中添加1%青鏈雙抗。

4. 把 50 ml 離心管橫放于 37 ℃細胞培養箱，靜置16小時。（若使用旋轉法，則置于37 ℃細胞培養箱中旋轉4 h，轉速為10 rpm。）

5. 消化反應結束之前，預先在6孔板中加入1ml完全培養基（NutriStem XF Basal Medium+5%PLTGold），置于37℃細胞培養箱中孵育1小時，達到預包被的效果。

注1：推薦使用MSC Attachment Solution（BI，Cat：05-752-1F）包被，效果更好。

6. 加入和分離液等體積的0.05%EDTA （BI，Cat：03-015-1B）終止反應后，將樣品轉移至15ml離心管中，1200xg 離心5分鐘，離心時調至最慢降速（有剎車），去除上清，溶液比較濃稠，小心不要影響下層的細胞；建議留下 2 ml 左右的溶液。

7. 以和分離液等體積的DPBS+1%青鏈雙抗重懸細胞后，500 xg 離心 5 分鐘，離心時調至最慢降速（有剎車），小心去除上清，不要影響下層的細胞；建議留下 1.5 ml左右的溶液。重復本步驟操作3次。

8. 用適量的培養基重懸細胞后（重懸后細胞懸液總體積為3 ml），計數細胞密度，即可按常規細胞培養方法接種原代細胞培養。（原代細胞推薦用NutriStem XF Basal Medium+5%PLTGold培養）

注：消化后的原代細胞，建議培養時接種密度提高10000/cm²以上；傳代后即可按常規的接種密度（5000~6000/cm²）培養。

UC-MSC傳代培養與凍存

1. 待細胞融和度達到約80%后進行傳代（細胞不能太密集，否則容易分化），吸棄傳代板孔中的培養基，每孔加適量DPBS輕輕沖洗1次。

2. 根據培養皿適量加入重組胰酶-EDTA（BI，Cat：03-079-1A，T25建議使用1 ml），在37℃，5% CO₂培養箱作用3~5 min（可輕拍培養瓶幫助細胞脫落）。

3. 顯微鏡下觀察細胞完全脫落后，使用5-10 ml稀釋大豆胰酶抑制劑（SBTI，BI，Cat：03-048-1，1X），1000 rpm離心3~5 min。

4. 謹慎吸出上清，細胞團塊用適當體積的完全培養基懸浮后，混勻細胞懸液。

5. 按照所需的比例進行傳代或按照5000-6000cells/cm²的細胞密度將細胞接種至培養器皿中，放入37℃，5% CO₂培養箱內培養。

6. 每2-3天更換一次培養基，待細胞融合度達到80%左右時，參照上述操作步驟1~5做細胞傳代；或者參照操作步驟1~3收獲細胞凍存。

7. 細胞凍存：將細胞團塊懸浮于適量NutriFreez® D10無血清凍存液（Cat：05-713-1）中，裝入凍存管，2~8℃冰箱放置30 min，-80℃冰箱放置 24 h，轉入液氮罐凍存。

注1：本方法僅供參考，用戶可根據自身經驗做合理調整。

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BI 中國市場部：上海逍鵬生物科技有限公司
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