細胞凍存時需要注意的事項和技巧
Master Cell Cryopreservation
掌握細胞凍存
掌握細胞凍存
做實驗的時候為什么要進行細胞凍存呢？
細胞凍存有哪些好處呢？
01 節省實驗室空間、時間、經費
02 若實驗失敗，還有重來的機會
03 確保重復實驗的一致性
04 確保未來實驗的連貫性
但是，經常會有用戶反映，細胞凍存與復蘇遇到了問題，看來看似簡單的一步其實并不簡單。
那么如何做好細胞凍存呢？今天跟隨我們一起來了解一下細胞凍存時需要注意的事項和技巧吧。
細胞凍存的基本原理
細胞代謝過程需要各種蛋白酶的參與，而這些蛋白酶在環境溫度低于-70℃時會集體罷工，低溫貯藏的目的是通過超低溫使代謝活動近乎停止。細胞因此進入休眠狀態，使細胞“不會老”，可以長期保存。
因為凍融過程對所有細胞和組織都是有一定傷害的，因此，需要開發出有效的技術來防止細胞死亡和損傷。
因為凍融過程對所有細胞和組織都是有一定傷害的，因此，需要開發出有效的技術來防止細胞死亡和損傷。
Ultralow storage temperatures suspend all molecular processes and prevents free radical generation that negatively effects cryopreserved cultures(Baust J., 2007; Baust, Corwin, Van Buskirk, & Baust, 2015).
這時，低溫保護劑就發揮出它的作用了。
低溫保護劑可保護細胞不受細胞內冰凍影響，目前多采用DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等滲透型低溫保護劑。它們的作用機制包括：自由進入細胞，取代水，使冰點下降，充當鹽的二次溶劑，提高細胞膜對水的通透性。如下圖所示：
這時，低溫保護劑就發揮出它的作用了。
低溫保護劑可保護細胞不受細胞內冰凍影響，目前多采用DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等滲透型低溫保護劑。它們的作用機制包括：自由進入細胞，取代水，使冰點下降，充當鹽的二次溶劑，提高細胞膜對水的通透性。如下圖所示：
但是，部分低溫保護劑在緩慢冷凍過程中雖然會保護細胞，但它們也會引起細胞毒性，尤其是在室溫下。因此，在標準的自制凍存液中，會含有血清，血清是用來降低細胞毒性的，但血清也不是完美的。
那么有無動物源成分替換物嗎？
甲基纖維素已被認為是細胞冷凍保存的保護劑，可作為胎牛血清的合適替代物。
1. 化學成分明確
2. 保護性
甲基纖維素結構圖
Mizrahi A, Moore GE, Appl Microbiol. 1970 Jun; 19(6):906-10 Merchant DJ, Hellman KB, Schneider H, Muirhead EE.
盡管大多數研究和醫學領域都存在優化的冷凍保存方案和已發表的配方，但技術問題依然存在。
盡管大多數研究和醫學領域都存在優化的冷凍保存方案和已發表的配方，但技術問題依然存在。
Baust J., 2007; Van Buskirk, 2007; Baust, Corwin, Van Buskirk, & Baust, 2015; Allegrucci & Young.
如何選擇凍存液
首先我們需要明確首要任務是什么？我們的細胞需要什么？
l 回收率？
l 存活率？
l 低溫保存培養基成分？
l 無血清或無外源性要求？
l 我需要使用哪個方法？
l 商業培養基相比于自制培養基的優勢？
Biological Industries推出了一種即用型，無動物源成分的凍存液：
下圖為NutriFreez® D10凍存液適用的細胞類型：
Biological Industries使用人間充質干細胞（hMSC）、人多能干細胞（hPSC）和一些其他的細胞系對NutriFreez® D10凍存液進行了驗證實驗：
人間充質干細胞（hMSC）
Biological Industries使用NutriFreez® D10凍存液與市面上其他兩種凍存液對hMSC細胞的細胞形態及存活率進行了比較：
存活率 細胞數量對比
細胞形態
如圖所示，用NutriFreez® D10冷凍保存的hMSC復蘇當天的存活率為95%；復蘇后3天的細胞數量增加超過7倍，細胞在生長3天后比其他產品更好的恢。
我們比較了用D10凍存液和另外兩種凍存液凍存的人間充質干細胞，復蘇后的細胞增殖狀況和形態。對比可知，D10凍存液凍存的細胞復蘇后具有更高的細胞密度和正常的細胞形態。
1.hMSC低溫保存復蘇后的增殖和形態比較：
我們比較了用D10凍存液和另外兩種凍存液凍存的人間充質干細胞，復蘇后的細胞增殖狀況和形態。對比可知，D10凍存液凍存的細胞復蘇后具有更高的細胞密度和正常的細胞形態。
1.hMSC低溫保存復蘇后的增殖和形態比較：
hMSC-BM（左圖）；hMSC-AT（右圖）
如圖，是人間充質干細胞在D10凍存液中凍存不同時間，復蘇后的存活率比較。從結果可以看出，人骨髓來源的間充質干細胞和脂肪來源間充質干細胞在D10凍存液中冷凍保存3年后相比于保存一年半仍然具有很高的存活率。
2. 各種hMSC在NutriFreez® D10培養基中低溫保存復蘇后的存活率比較：
如圖，是人間充質干細胞在D10凍存液中凍存不同時間，復蘇后的存活率比較。從結果可以看出，人骨髓來源的間充質干細胞和脂肪來源間充質干細胞在D10凍存液中冷凍保存3年后相比于保存一年半仍然具有很高的存活率。
2. 各種hMSC在NutriFreez® D10培養基中低溫保存復蘇后的存活率比較：
接下來是各種人間充質干細胞在用D10凍存液凍存，復蘇后的存活率比較。可見來自脂肪組織（AT）、骨髓（BM）和牙髓（DP）的間充質干細胞，復蘇當天與復蘇3天后的存活率沒有明顯差異。
3. 不同類型hMSC在NutriFreez® D10培養基中低溫保存后的形態比較：
3. 不同類型hMSC在NutriFreez® D10培養基中低溫保存后的形態比較：
如圖所示，是各種人間充質干細胞在D10凍存液中凍存復蘇后的形態比較。脂肪（AT）、骨髓（BM）和牙髓（DP）來源的間充質干細胞，復蘇當天與復蘇3天后的形態均正常。
4. 表面標志物表達分析：
4. 表面標志物表達分析：
多種人間充質干細胞用D10凍存液凍存，復蘇后，通過流式細胞熒光分選技術分析，依然保持表面標志物表達。
5. hMSC細胞的存活率的比較：
5. hMSC細胞的存活率的比較：
通過臺盼藍排除和膜聯蛋白V / PI染色結合流式細胞儀分析對自制和其他品牌凍存液凍存的細胞進行復蘇后活力比較。與自制和競爭品牌相比，用D10凍存液凍存的原代人間充質干細胞復蘇后表現出最佳的存活率，此外還提高了細胞粘附和生長性能。
6. 在解凍后6天細胞復蘇率對比：
相比之下，在NutriFreez® D10凍存液中保存的原代人間充質干細胞（來自健康供體）在解凍后的回收率最高，此外還提高了細胞的粘附和生長性能。復蘇后第6天表現出最佳的復蘇率。
人多能干細胞（hPSC）
1. 復蘇后形態對比：
如圖所示，人多能干細胞在NutriFreez® D10培養基中低溫保存復蘇后表現出更好的恢復和形態。
細胞克隆效果顯著，細胞集落形態正常，表現出更好的復蘇效果。
2. 分化潛能分析：
利用 hematoxylin -伊紅染色法對自發形成的18天后的胚狀體進行組織學切片染色鑒別人胚胎干細胞。hPSC在D10凍存液凍存，復蘇后仍能保持多項分化潛能。
3. 單細胞附著能力分析：
3. 單細胞附著能力分析：
用D10凍存液凍存，復蘇后觀察單細胞復蘇，形態和附著。ACS-1019細胞和附著能力強。
4. 標志物表達：
4. 標志物表達：
在不影響人胚胎干細胞復蘇后未分化狀態和膨脹率的情況下，驗證性研究用D10凍存液適當低溫凍存人多能干細胞的能力。未分化的人多能干細胞中Oct3/4和SSEA4標志物表達超過85%。
5. 驗證性研究
在不影響hPSC解凍后未分化狀態和膨脹率的情況下，低溫保存hPSC的能力。
5. 驗證性研究
在不影響hPSC解凍后未分化狀態和膨脹率的情況下，低溫保存hPSC的能力。
核型分析分辨率為500-550條帶時未檢測到克隆異常，這是正常的核型。
研究證實，使用D10凍存液凍存的hPSC，復蘇后細胞增殖、分化、形態或核型沒有受到影響。D10凍存液符合WiCell干細胞庫的質量要求，當按照指導使用時，適合用于hPSC的低溫保存。
研究證實，使用D10凍存液凍存的hPSC，復蘇后細胞增殖、分化、形態或核型沒有受到影響。D10凍存液符合WiCell干細胞庫的質量要求，當按照指導使用時，適合用于hPSC的低溫保存。
原代及多種細胞系的驗證
1. 人外周血單核細胞存活率比較：
與在自制凍存液凍存的細胞相比，用D10凍存液凍存的外周血單核細胞，復蘇后的存活率高達91%。
2. 人臍靜脈內皮細胞：
2. 人臍靜脈內皮細胞：
用D10凍存液凍存，復蘇后表現出94%的存活率和較高的細胞產量，復蘇第4天后人臍靜脈內皮細胞形態正常。
用抗內皮細胞表面CD31、CD144和CD90的抗體標記臍靜脈內皮細胞并用D10凍存液凍存，復蘇后，通過流式細胞儀檢測，依然維持表面標記物的表達。
3. 人真皮微血管內皮細胞：
3. 人真皮微血管內皮細胞：
存活率 細胞形態
人真皮微血管內皮細胞用D10凍存液凍存，復蘇后存活率高達96%。復蘇后第4天保持正常細胞形態。
4. 多種細胞系不同時長存活率比較：
4. 多種細胞系不同時長存活率比較：
多種細胞系用D10凍存液凍存不同時長，復蘇后的存活率比較，相比凍存6個月，凍存4年的細胞復蘇率略有下降，但依然處于較高水平。
5. 多種細胞系存活率及貼壁率比較：
5. 多種細胞系存活率及貼壁率比較：
據圖可知，不同細胞系的貼壁率和存活率有明顯差異；同一種細胞系，用D10凍存液凍存比用自制凍存液凍存，復蘇后的貼壁率和存活率更高，意味著D10凍存液具有更好的凍存效果。
資 質
Biological Industries同時也委托WiCell做了相關驗證測試。
WiCell---One of the leading hESC cell banks in the United States
WiCell測試表明在不影響未分化狀態和解凍后擴增速率的情況下，用NutriFreez® D10凍存液凍存的人多能干細胞在細胞的增殖、分化、形態及核型無影響。
WiCell---One of the leading hESC cell banks in the United States
WiCell測試表明在不影響未分化狀態和解凍后擴增速率的情況下，用NutriFreez® D10凍存液凍存的人多能干細胞在細胞的增殖、分化、形態及核型無影響。
低溫凍存技巧
冷凍凝固的過程中，水分子會在0℃~-20℃區間形成不同形狀的結晶。
在細胞凍存時“降溫速度、冰晶形成量和細胞滲透壓改變程度”是影響凍存成功的關鍵因素。
降溫速度慢：冰晶由細胞外開始形成，造成胞外滲透壓變小，細胞內水分移動至細胞外造成細胞脫水。
降溫速度快：水分流動時間短，細胞內外滲透壓改變程度小，但大量水分留在細胞內造成大量胞內冰晶形成，使得胞器損壞。
這些影響都會讓細胞損傷、凋亡或壞死，也可能造成復蘇后細胞存活率低、細胞形態改變、細胞功能喪失、基因變異等現象。
由此可知，最適合的凍存條件為“在增加細胞滲透壓穩定性的溶液中，以慢到能減少胞內冰晶形成，但也足夠快到能預防細胞脫水的降溫速度凍存細胞”。
由此可知，最適合的凍存條件為“在增加細胞滲透壓穩定性的溶液中，以慢到能減少胞內冰晶形成，但也足夠快到能預防細胞脫水的降溫速度凍存細胞”。
慢凍快融
慢凍→兩種辦法：
手動降溫：將細胞依序放在4℃（30分鐘）、-20℃（1小時）、-80℃（過夜）后移至液氮中保存。
程序降溫盒：是一般最廣泛使用的降溫法，為一種特制冷凍容器（填充異丙醇或依靠特制金屬導熱），使細胞以每分鐘約-1℃的速度降至-80℃（過夜），然后移至液氮中保存。
由此可以看出，程序降溫精準度更高，優于手動降溫。
大家可以根據自身情況或者實驗條件選擇不同的凍存方式。
快融：
將凍存在液氮中的細胞凍存管快速移至已37℃預熱的水浴鍋中（水面需低于管口，避免水分意外進入凍存管造成潛在污染），使細胞冷凍懸液迅速融化，此做法能讓細胞冷凍懸液快速通過-20℃~0℃這個結晶形成溫度范圍，避免冰晶進入細胞形成再結晶，對細胞造成二次傷害。
FAQ：
大家可以根據自身情況或者實驗條件選擇不同的凍存方式。
快融：
將凍存在液氮中的細胞凍存管快速移至已37℃預熱的水浴鍋中（水面需低于管口，避免水分意外進入凍存管造成潛在污染），使細胞冷凍懸液迅速融化，此做法能讓細胞冷凍懸液快速通過-20℃~0℃這個結晶形成溫度范圍，避免冰晶進入細胞形成再結晶，對細胞造成二次傷害。
FAQ：
References
1. B. Liu, et al. Chemically defined and xeno-free culture condition for human extended pluripotent stem cells. Nat Commun (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-23320-8.
2. N. Aydoğdu, et al. Isolation, Culture, Cryopreservation, and Preparation of Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells as a Final Cellular Product Under Good Manufacturing Practices–Compliant Conditions. Methods in Molecular Biology. (2020) Springer, New York, NY. https://doi.org/10.1007/7651_2020_332.
3. R. E. Burnham, et al. Human serum albumin and chromatin condensation rescue ex vivo expanded γδ T cells from the effects of cryopreservation. Cryobiology, 2021, ISSN 0011-2240, https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2021.01.011.
4. S. Reichman, et al. Compositions and Methods for Efficient Amplification of Retinal Progenitors Cells. US Patent App. 16/976581, 01/07/2021.
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