新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19），簡稱“新冠肺炎”，已在全世界范圍造成巨大的危害，導致數百萬人失去生命，對人們的工作和生活造成巨大的影響。其特點是缺氧，迅速惡化，并伴有發展為急性呼吸窘迫綜合征、多器官衰竭甚至死亡的風險。由于未能完全了解發病機制和患者間異質性，限制了以biomarker為導向的靶向精確醫學方法研究。本文中，研究者利用多組學研究思路，解析新冠肺炎患者血液特征，構建了多組學分子圖譜，并與膿毒癥和流感患者進行比較，為個性化藥物治療方法的發展奠定基礎。

文章詳情    

文章題目：A blood atlas of COVID-19 defines hallmarks of diseaseseverity and specificity

中文題目：新冠肺炎的血液圖譜定義了疾病嚴重程度和特異性的特征

發表時間：2022.03

期刊名稱：Cell

影響因子：41.582

實驗平臺：10x Genomics 單細胞測序多組學+Tims-TOF 4D蛋白質組學檢測等技術

DOI：10.1016/j.cell.2022.01.012

研究內容    

·  新冠肺炎的臨床特征、嚴重程度和疾病分級

研究者首先使用質譜流式和CITE-seq技術，以單細胞分辨率在轉錄組和蛋白質組水平上解析PBMC的類型、亞型和類群（圖1A-C）。結果表明，在更嚴重或危重的病例中中性粒細胞的絕對和相對豐度增加，而T、B淋巴細胞、髓樣細胞、樹突狀細胞（DC）、嗜堿性粒細胞和NK細胞減少（圖1D）。在社區型和康復的新冠患者中，細胞組成與健康志愿者大致相似，豐度上存在一些差異。中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、漿母細胞和PDC的頻率是影響患者組間細胞組成的重要因素。單獨分析住院的新冠肺炎病例時，最大的變異成分（PC1）與組成員、氧合狀態和淋巴細胞計數有關（圖1F），更高豐度的血小板/CD34-巨核系祖細胞和循環cMono與氧合狀態、嚴重程度和CRP有關。血小板/CD34-巨核系祖細胞豐度也與血栓栓塞的發生有關（圖1H），強調了它們在嚴重新冠肺炎中潛在的病理生理學意義。

Fig.1 單細胞成分分析揭示了不同臨床組和嚴重程度的細胞群差異

·  新冠肺炎全血特征和嚴重程度涉及中性粒細胞、祖細胞、淋巴細胞耗竭、凝血、免疫球蛋白和干擾素反應

接下來，研究者使用全轉錄組測序對全血進行解析，以獲得宿主對新冠肺炎反應的轉錄組特征，并發現在不同組間的樣品存在明顯的分離（圖2A）。在住院的新冠患者中，最大的方差分量與28天死亡率相關（PC1）（圖2B），與這個成分有關的基因富集于免疫系統功能（尤其是中性粒細胞脫粒）、PD-1信號、抗菌肽和凝血級聯。而在不同嚴重程度患者中差異表達的基因主要富集在TCR和PD-1信號、抗菌肽、顯微蛋白凝塊形成、整合素和免疫調節相互作用以及血小板和中性粒細胞脫粒（圖2C和2D）。與膿毒癥相比，新冠肺炎的特點包括許多免疫球蛋白heavy/kappa/lambda基因的上調和與細胞增殖、先天/獲得性免疫功能相關的獨特通路富集。隨后，研究者使用WGCNA分析確定了與新冠肺炎嚴重程度高度相關的基因模塊。MEGrey60模塊在危重癥新冠肺炎中的表達高于膿毒癥，并且ERG基因顯示出最高的模塊內連接（connectivity）（圖2F）。這些結果說明這個模塊代表了與嚴重程度相關的多種祖細胞，進一步支持了這些細胞的重要性。全血中存在不成熟中性粒細胞和中性粒細胞前體細胞，在新冠患者中，中性粒細胞CD49d的表達上升，CD43降低，但在膿毒癥患者中基本沒有變化，CD49d/CD43比值在恢復期保持較高水平（圖2G）。

Fig.2 新冠肺炎的轉錄組特征

·  新冠肺炎共享和細胞類型特異性的單細胞基因表達特征涉及ZFN、核糖體和細胞周期基因、AP-1和干擾素信號轉導

在住院和社區型新冠患者中，研究者發現基因表達的差異主要涉及cMono、幼稚B細胞、漿母細胞、CD4⁺T細胞和循環NK細胞（圖2H）。再次使用WGCNA確定主要細胞亞群的網絡模塊，在細胞群中發現了一組 I 型 IFN 反應模塊，其中具有代表性的基因表達譜（模塊特征基因）與較輕的疾病、更好的氧合狀態和從癥狀發作開始的早期采樣相關。第二個模塊基因富集于AP-1和p38MAPK級聯反應基因，第三個模塊富含經典 (C2H2) 鋅指 (ZNF) 基因，包含 IRF2 和 IL16，第四個模塊涉及核糖體蛋白和炎癥小體功能，與單核細胞COVID-19嚴重程度呈負相關。最后，研究者發現了一組“周期”模塊，在cMono中與嚴重程度有關。此外，還鑒定到了CD4⁺ T細胞中JAK-STAT/白細胞介素信號模塊，以及 cMono 中的 EGFR 通路富集模塊（圖3A-H）。

Fig.3 單細胞基因表達模塊鑒定新冠肺炎反應的特征

·  單核細胞群嚴重程度的轉錄組和表觀遺傳學特征

對特異性單核吞噬細胞群進一步分析發現病情程度較重的住院新冠患者cMono比例相對更高，而中間單核細胞、ncMono和DC更低。隨著疾病嚴重程度的增加，發現cMono的表型轉變為較低的HLA-DR、CD33和CD11c的表達，存在增殖性單核細胞，這與膿毒癥患者的變化類似。與重癥/危重新冠肺炎患者相比，膿毒癥pDC和CD33^lowcDC2水平較低（圖4A-C）。與健康志愿者相比，新冠肺炎危重病例、流感和膿毒癥患者中的周期類群和抗氧化性金屬硫蛋白基因高表達的類群顯著增加。利用單細胞ATAC seq分析染色質的可及性，發現可及性差異最大的染色質峰相關基因包括STK24和FGFRL1。DNA結合motifs最顯著富集于AP-1、SW1/SNF和Bach轉錄因子家族成員（圖4E）。與健康志愿者相比，新冠肺炎患者髓樣細胞中包含FOS和JUN motifs的基因組區域可及性更高，這一信號在恢復期也可以看到（圖4F）。

Fig.4 髓樣細胞和淋巴細胞亞群的變化與新冠肺炎嚴重程度有關

·  新冠肺炎的嚴重程度與特異的T和NK細胞群以及與細胞周期、氧化還原狀態和衰竭相關的特征相關

在所有新冠肺炎患者組中，活化的CD4+和CD8+T細胞的頻率都有所增加，并在恢復期保持高水平。CD27⁺的活化CD4⁺T細胞比例高于膿毒癥患者，而CD56⁺細胞毒性CD8⁺T細胞比例降低（圖4A）。雖然在急性新冠肺炎患者中活化的CD4⁺T細胞中有激活、增殖和耗竭marker的表達，但隨著疾病嚴重程度的增加，CD8⁺T細胞中這些marker增加（圖4G）。隨著新冠肺炎嚴重程度的增加，類先天淋巴細胞群發生變化，包括MAIT細胞，表現出一種涉及細胞激活嚴重程度的變化梯度（圖4H）。

·  重癥新冠肺炎與未突變B細胞的克隆性增殖和自身反應性B細胞的激活有關

接下來，研究者利用bulk VDJ測序來研究全血中B細胞的免疫組庫。在健康志愿者中，克隆性擴張在記憶B細胞群體中占主導地位。而在新冠肺炎和膿毒癥患者中，漿母細胞擴張，嚴重和顯著危重的新冠肺炎患者也在記憶群體中存在克隆。漿母細胞的克隆性擴張具有統計學意義，并且與新冠肺炎嚴重程度相關，而膿毒癥則沒有顯著變化（圖5B）。新冠肺炎患者幼稚B細胞和漿母細胞之間存在分化方向，與膿毒癥患者不同，并與新冠肺炎以濾泡外B細胞為主的反應一致（圖5D）。接下來，研究者測試了靶向自身抗原和紅細胞抗原的B細胞是否與新冠肺炎有關，發現自身反應性IGHV4-34BCR在IGHD/M中顯著耗盡，但在類轉換B細胞中升高，最顯著的是IGHA2和IGHG2 B細胞（圖5E），與這些自身反應性B細胞在對SARS-CoV-2的反應中的類別轉換一致。在膿毒癥病例中，沒有觀察到IGHV4-34自身反應性BCR水平或類別轉換的明顯差異。上述結果表明，重癥新冠肺炎患者的漿母細胞擴張包括高水平的廣泛自身反應性B細胞，這與B細胞驅動的免疫病理的新作用相一致。

Fig.5 B和T細胞免疫組庫的差異與新冠肺炎嚴重程度相關

· CD8⁺T細胞群體免疫組庫多樣性降低

研究者分析新冠肺炎和T細胞克隆性之間的關系發現在考慮年齡的情況下，重癥和危重新冠肺炎患者中CD8⁺T 效應記憶、CD8⁺ T中央記憶和 MAIT 細胞多樣性降低，膿毒癥也有類似的變化。在住院患者中，隨著疾病嚴重程度的增加，含有TCR的CD8⁺T效應記憶細胞的比例較低（圖5J）。危重患者的SARS-CoV-2反應性細胞未能擴張為效應表型，或者擴張的細胞可能有明顯的重新分布。CD8⁺T效應記憶細胞在危重疾病中的新冠肺炎克隆型相對耗竭（圖5M）。

· 新冠肺炎血漿蛋白質組揭示嚴重程度和疾病特異性的相關性涉及急性期蛋白、代謝過程和組織損傷的標志物低

作為對多組學研究的補充，研究者使用LC-MS/MS 技術研究血漿蛋白組特征，并發現了嚴重程度和病因的差異。嚴重疾病與急性期蛋白、補體系統蛋白、補體膜攻擊復合體成分和與功能相關的蛋白質家族上調有關（圖6A和B）。通過蛋白質互作網絡分析對蛋白質進行聚類分析發現一個大類群，富集于包含膽固醇運輸和纖維蛋白血栓的生物學過程。兩個較小的富集于細胞溶解和補體激活的類群與疾病嚴重程度呈正相關（圖6C）。與樣品間差異主要相關的過程有急性期反應和炎癥、代謝和膽固醇運輸。輕度住院的新冠肺炎患者在類維生素A、膽固醇、脂蛋白和脂溶維生素的囊泡運輸和代謝過程上與健康志愿者不同；而社區患者的補體激活和凝血水平更高。將重癥和膿毒癥患者進行比較發現了19個蛋白顯示出新冠肺炎特有的變化，表現為急性期反應增強、補體活化和受體介導的內吞作用。

· 血漿細胞因子和趨化因子圖譜顯示炎癥介質參與的證據

為了表征SARS-CoV-2應答的炎癥介質，研究者使用Luminex分析了51個循環細胞因子和趨化因子蛋白。結果表明，與健康志愿者相比，49%新冠肺炎患者的血漿中分析物含量豐度不同，其中其中CCL2、CCL19等上調表達的因子與住院新冠肺炎患者病情嚴重程度密切相關（圖6D）。進一步與膿毒癥和流感進行比較，發現重癥/危重新冠肺炎患者血漿G-CSF、IL-8、TNF等蛋白水平水平低于膿毒癥（圖6E）。使用蛋白質—臨床特征分析解析新冠肺炎嚴重程度發現臨床特征與GM-CSF、CXCL10和TREM-1等蛋白質存在強烈相關性（圖6F）。

Fig.6 新冠肺炎的血漿蛋白質特征及其亞表型

· 血漿蛋白質組變異鑒定不同疾病嚴重程度的患者亞型

利用SNF整合LC-MS/MS 和 Luminex數據，通過對疾病嚴重程度分析（吸入氧濃度和SOFA氧氣評分）發現了兩個分離的類群，并鑒定到11個蛋白質作為分類的主要判別特征（圖6G）。當比較這兩個類群時發現類群2與較高的28天死亡率相關（圖6H）。在另一個利用Olink蛋白檢測技術的隊列中進行驗證發現，利用11個預測蛋白質中的7個確定了2個最佳類群，這些與疾病嚴重程度有明確關系（圖6I），區分新冠肺炎和膿毒癥的特征包括在膿毒癥中升高的LCN2和CCL20，以及在新冠肺炎中升高的CXCL10、APCs和FN1。

· 有監督機器學習鑒定預測疾病嚴重程度的蛋白質biomarkers

使用機器學習將兩種蛋白質組學數據和全血全轉錄組測序整合分析，確定了實驗類型特異性的方差信息成分，以降低訓練樣品集的維度，然后確定哪些信息最豐富，哪些基因/蛋白質對每個成分的貢獻最大（圖7A）。分析結果表明，急性期蛋白SAA2和CRP、IGHG4、趨化因子(CCL20和CCL2)、IL-6和補體成分C5a可預測嚴重程度，在hold-out驗證集中驗證這些特征的綜合表現，預測WHO類別組的平衡準確率為75%-80%（圖7B）。此外，還在住院新冠肺炎患者和膿毒癥患者中篩選特征，結果鑒定到81個特征，確定了特異的差異表達基因、蛋白質和顯著富集的一些通路包括造血細胞譜系和腎素-血管緊張素系統。

· 新冠肺炎嚴重性和特異性的綜合標志

利用SDA算法，從細胞組成、基因表達和血漿蛋白質組學角度入手，對152個樣品進行分析，發現了381個潛在的SDA成分（圖7C和D）。其中成分171與新冠肺炎嚴重程度最相關，該成分的高特征貢獻來自血漿蛋白質，包括升高的血漿趨化因子（趨化和激活、GM-SCF以及急性期激活蛋白、LRG1和LBP）、豐度降低的中間單核細胞、高表達的細胞應激伴侶CLU和甲基轉移酶 METTL7B、下調表達的IgE受體和多個HLA II類基因，以及抗原呈遞、TCR 信號傳導和哮喘的通路富集（圖7E）。進一步分析發現于健康志愿者相比，有130個SDA成分與新冠肺炎有關。與輕、重度但非危重疾病相關的成分包括成分256(干擾素反應基因上調，過氧化氫酶和細胞色素c氧化酶等基因下調，該成分是新冠肺炎患者特有的）和成分42（圖7F）。這種方法還發現了另一個新冠肺炎特有的成分187，它在住院和社區新冠肺炎患者中的NK、B和T細胞中具有高負荷分數（圖7G）。此外，研究者還鑒定到新冠肺炎和流感相關的成分，包括廣泛上調的免疫球蛋白heavy/kappa/lambda基因、JCHAIN、與可能的抗體依賴的細胞毒性有關的MZB1(成分6)；以及顯著上調干擾素途徑基因(成分235)。（圖7H和I）。總體而言，潛在成分分析確定了關于膿毒癥和流感的新冠肺炎嚴重程度和特異性的特征。研究者發現了關鍵的細胞群體如增殖的單核細胞和漿母細胞，以及從干擾素信號到骨髓生成、免疫球蛋白產生和應激激活反應信號的固有和適應性機制的特征。

Fig.7 綜合性方法分析定義新冠肺炎反應的標志

主要結論  

本研究構建了一個關于不同新冠肺炎疾病程度的綜合型多組學血液圖譜，并與流感、膿毒癥患者和健康志愿者進行比較，鑒定到免疫特征和宿主反應的相關因素。疾病嚴重程度的特征涉及細胞、它們的炎癥介質和網絡，包括祖細胞和特定的髓樣和淋巴細胞亞群，免疫組庫的特征，急性期反應，代謝和凝血。持續的免疫激活涉及AP-1/p38MAPK，這是新冠肺炎的一個特征。血漿蛋白質組能夠對患者群進行亞表型分型，并能預測病情嚴重程度和預后。基于系統的綜合分析顯示，與流感和膿毒癥相比，特征分組與嚴重性和特異性有關。綜上所述，研究者使用的方法和構建的血液圖譜將有助于未來的藥物開發、臨床試驗設計和新冠肺炎的個性化用藥方法。

參考文獻

A blood atlas of COVID-19 defines hallmarks ofdisease severity and specificity. Cell vol. 185,5 (2022): 916-938.e58. .