利用Labelfree蛋白組學(xué)技術(shù)解析抗精神病藥物的心臟毒性機(jī)制
長期使用抗精神病藥物是導(dǎo)致心肌損傷甚至心臟性猝死的常見原因，常常導(dǎo)致停藥或治療不連續(xù)。但是抗精神病藥物對心臟產(chǎn)生毒性的機(jī)制很大程度上仍然是未知的。
2022年6月，復(fù)旦大學(xué)遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室金力院士與復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院鄒云增教授及復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院李立亮副教授團(tuán)隊(duì)合作，在Nature旗下Signal Transduction and Targeted Therapy（IF 38.104）雜志上發(fā)表了題為“CB1R-stabilized NLRP3 inflammasome drives antipsychotics cardiotoxicity”的研究論文，該文章利用Labelfree蛋白組學(xué)、RNA測序等方法發(fā)現(xiàn)NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡主要與多種抗精神病藥物的心臟毒性有關(guān)，且發(fā)現(xiàn)CB1R 是NLRP3 炎性體的上游調(diào)節(jié)劑。此外，篩選到了安全、低毒的CB1R拮抗劑作為藥物毒性的聯(lián)合治療策略。中科新生命為該研究提供了Labelfree蛋白組學(xué)技術(shù)服務(wù)。
研究材料：小鼠心肌細(xì)胞、基因敲除小鼠、人心臟組織
技術(shù)路線：
1. 抗精神病藥 (AP) 早期可引起心臟毒性
2. 多種AP藥物激活NLRP3炎癥小體，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞焦亡
3. NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的焦亡與AP藥物的心臟毒性密切相關(guān)
4. CB1R是AP藥物的直接靶點(diǎn)，對NLRP3炎性小體起重要調(diào)控作用
5. CB1R通過177-209氨基酸殘基與NLRP3炎癥小體相互作用并阻止其降解
6. Cb1r基因敲除改善AP藥物誘導(dǎo)的焦亡和心臟毒性
7. CB1R抑制劑保護(hù)小鼠免受AP藥物的心臟毒性而不引起額外的副作用
8. 在人心臟標(biāo)本中，CB1R的表達(dá)與AP藥物誘導(dǎo)的焦亡和纖維化程度呈正相關(guān)
研究結(jié)果
1. 表型分析：抗精神病藥 (AP) 早期可引起心臟毒性
研究人員首先使用抗精神病藥奧氮平(Olz)_對小鼠進(jìn)行日常治療，然后進(jìn)行多器官毒性評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著抗精神病藥給藥時間延長，AP藥物在心臟中出現(xiàn)了明顯的蓄積，且AP藥物引起的心臟毒性比糖脂代謝紊亂或其他功能障礙的發(fā)生更早出現(xiàn)。
圖1 抗精神病藥對心臟的毒性作用
2.機(jī)制分析（轉(zhuǎn)錄組學(xué)）：多種AP藥物激活NLRP3炎癥小體，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞焦亡
接下來研究人員對Olz處理后的心臟進(jìn)行RNA測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GO富集分析中程序性細(xì)胞死亡途徑，特別是炎癥體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡顯著富集。WB等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性小體（由ASC、Caspase-1和NLRP3組成的復(fù)合體）和促炎因子(IL-1β、IL-18等)的蛋白水平以O(shè)lz劑量和時間依賴性的方式顯著增強(qiáng)。其他兩種AP藥物氯氮平(Clz) 和喹硫平(Que)與Olz發(fā)揮了相同的作用，也會導(dǎo)致促炎因子的的分泌和焦亡蛋白的表達(dá)。此外通過敲除焦亡基因或加入NLRP3炎癥小體抑制劑等方式，研究人員確定NLRP3炎性小體參與AP藥物誘導(dǎo)的焦亡且焦亡在AP藥物細(xì)胞毒性中的特異性。
圖2 AP藥物激活NLRP3炎癥小體，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞焦亡
3.功能驗(yàn)證：NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的焦亡與AP藥物的心臟毒性密切相關(guān)
為了評估NLRP3炎性小體介導(dǎo)的心力衰竭是否與AP藥物誘導(dǎo)的心臟毒性作用有功能關(guān)聯(lián)，作者使用NLRP3抑制劑/Casp1抑制劑發(fā)現(xiàn)其限制了炎癥反應(yīng)和心臟的纖維化。焦亡效應(yīng)基因GSDMD的敲除實(shí)驗(yàn)也減少了炎癥浸潤和纖維化。綜上表明NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的焦亡與AP藥物的心臟毒性密切相關(guān)。
為了評估NLRP3炎性小體介導(dǎo)的心力衰竭是否與AP藥物誘導(dǎo)的心臟毒性作用有功能關(guān)聯(lián)，作者使用NLRP3抑制劑/Casp1抑制劑發(fā)現(xiàn)其限制了炎癥反應(yīng)和心臟的纖維化。焦亡效應(yīng)基因GSDMD的敲除實(shí)驗(yàn)也減少了炎癥浸潤和纖維化。綜上表明NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的焦亡與AP藥物的心臟毒性密切相關(guān)。
圖3 NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的焦亡與AP藥物的心臟毒性密切相關(guān)
4.機(jī)制解析（藥物靶標(biāo)蛋白）：CB1R是AP藥物的直接靶點(diǎn)，對NLRP3炎性小體起重要調(diào)控作用
為了揭示AP藥物激活焦亡的主要機(jī)制，研究人員分別進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的分析及聯(lián)合分析。根據(jù)聯(lián)合分析中共有的9條通路分別加入不同的抑制劑處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性Cannabinoids對于Olz誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的表達(dá)具有顯著的抑制效果。而Cannabinoid receptor 1, Cb1r是內(nèi)源性Cannabinoids的受體，故作者進(jìn)一步驗(yàn)證了CB1R是否為AP藥物的直接靶點(diǎn)。結(jié)果表明在Olz、Clz或Que暴露的小鼠原代心肌細(xì)胞中CB1R的表達(dá)均被促進(jìn)，且 AP藥物(Olz和Clz)可直接結(jié)合CB1R，并與主要的內(nèi)源性Cannabinoids(2-AG和AEA)在與CB1R結(jié)合時存在競爭結(jié)合模式。此外，研究發(fā)現(xiàn)AP藥物與CB1R結(jié)合后，通過CB1R的 S426或S430位點(diǎn)磷酸化而促進(jìn)了CB1R由膜轉(zhuǎn)位至胞漿（內(nèi)化）。另外研究發(fā)現(xiàn)，CB1R的過表達(dá)增強(qiáng)了NLRP3炎癥小體蛋白的表達(dá)。綜上所述，CB1R是NLRP3炎性小體的上游調(diào)節(jié)劑。
為了揭示AP藥物激活焦亡的主要機(jī)制，研究人員分別進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的分析及聯(lián)合分析。根據(jù)聯(lián)合分析中共有的9條通路分別加入不同的抑制劑處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性Cannabinoids對于Olz誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的表達(dá)具有顯著的抑制效果。而Cannabinoid receptor 1, Cb1r是內(nèi)源性Cannabinoids的受體，故作者進(jìn)一步驗(yàn)證了CB1R是否為AP藥物的直接靶點(diǎn)。結(jié)果表明在Olz、Clz或Que暴露的小鼠原代心肌細(xì)胞中CB1R的表達(dá)均被促進(jìn)，且 AP藥物(Olz和Clz)可直接結(jié)合CB1R，并與主要的內(nèi)源性Cannabinoids(2-AG和AEA)在與CB1R結(jié)合時存在競爭結(jié)合模式。此外，研究發(fā)現(xiàn)AP藥物與CB1R結(jié)合后，通過CB1R的 S426或S430位點(diǎn)磷酸化而促進(jìn)了CB1R由膜轉(zhuǎn)位至胞漿（內(nèi)化）。另外研究發(fā)現(xiàn)，CB1R的過表達(dá)增強(qiáng)了NLRP3炎癥小體蛋白的表達(dá)。綜上所述，CB1R是NLRP3炎性小體的上游調(diào)節(jié)劑。
圖4 CB1R是AP藥物的直接靶點(diǎn)，且是NLRP3炎性小體的上游調(diào)節(jié)劑
5. 機(jī)制解析（上下游蛋白的互作分析）：CB1R通過177-209氨基酸殘基與NLRP3炎癥小體相互作用并阻止其降解
為研究CB1R是否影響焦亡蛋白的合成或降解，作者使用蛋白質(zhì)合成抑制劑CHX并結(jié)合CB1R的過表達(dá)或敲除進(jìn)行研究，結(jié)果表明CB1R通過抑制NLRP3炎癥小體的降解來穩(wěn)定NLRP3炎癥小體。此外，通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)除ASC外，CB1R與NLRP3、Casp1和GSDMD存在直接的物理相互作用，結(jié)合區(qū)域?yàn)镃B1R的177-209氨基酸殘基。綜上所述，CB1R內(nèi)化后通過與NLRP3炎癥小體主要成分直接相互作用穩(wěn)定了NLRP3炎癥小體。
圖5 CB1R通過177-209氨基酸殘基與NLRP3炎癥小體相互作用并阻止其降解
6. 功能驗(yàn)證：Cb1r基因敲除改善AP藥物誘導(dǎo)的焦亡和心臟毒性
為驗(yàn)證CB1R在AP藥物誘導(dǎo)的焦亡和心臟毒性中的作用，作者將Cb1r基因敲除，研究發(fā)現(xiàn)Olz和Clz刺激后，Cb1r敲除小鼠表現(xiàn)為正常心功能，未表現(xiàn)出心臟重塑、纖維化組織積累等。而當(dāng)Cb1r基因過表達(dá)時，則相反，影響了心臟功能。
圖6 Cb1r基因敲除改善AP藥物誘導(dǎo)的焦亡和心臟毒性
7. 藥物篩選：CB1R抑制劑保護(hù)小鼠免受AP藥物的心臟毒性而不引起額外的副作用
為探究CB1R抑制劑在小鼠模型中的保護(hù)心臟的能力，作者檢測了CB1R拮抗劑AM251和AM281的體內(nèi)治療效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AM251或AM281處理小鼠后，炎癥小體數(shù)量明顯減少、活性受損、抑制了焦亡蛋白和纖維因子，同時心臟功能也得到了改善，此外也未引起額外的副作用。綜上所述AM 251和AM 281可能在保護(hù)心臟免受抗精神病藥物心臟毒性方面發(fā)揮更安全的作用。
圖7 CB1R抑制劑保護(hù)小鼠免受AP藥物的心臟毒性而不引起額外的副作用
8. 臨床驗(yàn)證：在人心臟標(biāo)本中，CB1R的表達(dá)與AP藥物誘導(dǎo)的焦亡和纖維化程度呈正相關(guān)
最后作者在人心臟標(biāo)本中評估了CB1R調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體的臨床轉(zhuǎn)化潛能。在真實(shí)的尸檢病例中，長期使用Clz或Olz的患者心臟中，有顯著的NLRP3炎性小體斑點(diǎn)、大量纖維組織積累，且NLRP3炎性小體斑點(diǎn)的數(shù)量或GSDMD表達(dá)量與心臟纖維化程度顯著相關(guān)、CB1R表達(dá)與纖維化程度、NLRP3炎性小體數(shù)目和GSDMD表達(dá)也具有良好的相關(guān)性。綜上所述， CB1R的異常表達(dá)與抗精神病藥物誘導(dǎo)的人類心臟細(xì)胞焦亡和纖維化相關(guān)。
圖8 人類心臟標(biāo)本中，CB1R表達(dá)與抗精神病藥物誘導(dǎo)的的焦亡和纖維化正相關(guān)
小結(jié)
本研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性小體介導(dǎo)的焦亡是AP藥物誘發(fā)心臟毒性的主要因素。NLRP3炎性小體的活性受CB1R控制，CB1R通過S426和S430內(nèi)化，并通過其177-209區(qū)域與NLRP3炎性小體發(fā)生物理相互作用，導(dǎo)致NLRP3炎性小體穩(wěn)定，并激活細(xì)胞焦亡，最終導(dǎo)致AP藥物的心臟毒性。此外，實(shí)驗(yàn)證實(shí)CB1R的抑制劑可保護(hù)小鼠免受AP藥物的心臟毒性且不引起額外的副作用。
標(biāo)簽：
蛋白質(zhì)組學(xué)
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