淺談細胞培養三大步驟

 

01 

復 蘇

細胞復蘇的原則：快速融化

 

必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。

 

 

實驗前準備

1. 將水浴鍋提前預熱至37℃。

2. 細胞實驗室進行常規消毒，用75％酒精擦拭紫外線照射40min的超凈工作臺臺面，保證無菌。

3. 在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養瓶等即將使用的耗材及試劑。

 

取出凍存管

1. 根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的對應編號。

2. 從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。

 

迅速解凍

1. 迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。

2. 約1-2min后凍存管內液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內。

 

平衡離心

用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min 離心3分鐘。

 

制備細胞懸液

1. 吸棄上清液。

2. 向離心管內加入適量完全培養液，吹打制成細胞懸液。

3. 用培養液懸液混懸沉淀細胞，細胞計數調整細胞濃度，放入培養箱中培養。

 

細胞計數

細胞濃度以5×10⁵/ml為宜。

 

培養細胞

將符合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶內，將培養瓶放入37℃，5％CO₂的培養箱內2-4h（或者24-48h）后換液繼續培養培養，換液的時間根據細胞情況而定。

 

記錄復蘇日期

 

 

 

結果分析

 

 

判斷細胞復蘇成功與否，需要看復蘇后細胞貼壁率及細胞存活率（細胞存活率將凍存管內剩余的細胞，臺盼藍染色法檢測復蘇細胞的存活率。呈藍色的細胞為死細胞，活細胞不著色。用細胞計數板和計數器計數細胞，得出細胞存活率）。

 

如果復蘇后95%以上的細胞貼壁，而且細胞的活性好，這就說明細胞復蘇的過程沒有問題。復蘇的細胞恢復到正常生長，達到正常的生長特性（比如細胞群體倍增時間等）后要再凍存以補充細胞儲存數量。

 

 

 

××  初學者易犯錯誤  ××

 

 

• 水浴鍋未提前預熱或者未預熱到37℃直接融化。

• 水浴鍋內凍存管太多，導致傳熱不佳，使融化時間延長。

• 離心前忘記平衡，導致離心機損壞和細胞丟失。

• 一次復蘇細胞種類過多，忘記更換吸頭和吸管，導致細胞交叉污染。

 

02 

傳 代

01

傳代密度過高

一旦細胞養太久至融合度過高（>90%）才傳代，容易使細胞產生老化現象，甚至是堆疊，再消化細胞時不易吹打成單顆細胞，即便再重新鋪盤傳代，細胞也無法回到原本的特性了。（如：單層細胞，沒長滿就發生堆疊現象）。

解決方案

盡量避免融合度過高，鏡下觀察融合度約達到80%即可傳代分盤。

細胞融合度：在細胞培養中指的是細胞在培養表面（培養皿/瓶）所占的比例。

 

02

傳代密度過低

哺乳動物貼壁培養細胞，若細胞培養到80-90%密度需要開始傳代，在傳代接種細胞密度過低，細胞間距離太遠，就無法在細胞間產生黏附及通信作用，幫助信號傳導并活化細胞；總體細胞量不足，分泌的生長因子濃度會不足以產生利于生長的微環境，以上皆會造成增殖速度遲緩或細胞死亡。

解決方案

細胞傳代時，要進行準確的細胞計數，確保鋪盤的密度。

 

如何確定細胞的正確初始接種密度? 

美國細胞庫（ATCC）建議各類不同細胞株接種密度：

 

細胞類型	接種密度
常見腫瘤細胞株	2-4 x 106 viable cells/625px2
成纖維細胞株	2-4 x 106 viable cells/25cm2
淋巴細胞/懸浮細胞	3-4 x 105 viable cells/ml
雜交瘤	2 x 105 viable cells/ml
成肌細胞	1-2 x 104 viable cells/cm2

https://www.atcc.org/support/faqs/8e032/Seeding%20Density%20for%20Cell%20Lines-25.aspx

 

 

03 

凍 存

細胞凍存的基本原理：慢凍

 

手動降溫：將細胞依序放在4℃（30分鐘）、-20℃（1小時）、-80℃（過夜）后移至液氮中保存。

 

程序降溫盒：是一般最廣泛使用的降溫法，為一種特制冷凍容器（填充異丙醇或依靠特制金屬導熱），使細胞以每分鐘約-1℃的速度降至-80℃（過夜），然后移至液氮中保存。

由此可以看出，程序降溫精準度更高，優于手動降溫。

 

	程序降溫	手動降溫
優點	主動監控溫度 一些控制速率的冷凍機不需要任何可消耗的制冷劑	不需要任何特殊器皿 成本低
缺點	受控速率凍結裝置 適當的存儲瓶 專門的冷凍溶液	專門的冷凍溶液 -80℃冷凍機 液氮罐
長時間保存	液氮或低溫儲存（只要低于-135℃即可）	液氮

 

大家可以根據自身情況或者實驗條件選擇不同的凍存方式。

 

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術將細胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。

 

細胞代謝過程需要各種蛋白酶的參與，而這些蛋白酶在環境溫度低于-70℃時會集體罷工，低溫貯藏的目的是通過超低溫使代謝活動近乎停止。細胞因此進入休眠狀態，使細胞“不會老”，可以長期保存。

 

因為凍融過程對所有細胞和組織都是有一定傷害的，因此，需要開發出有效的技術來防止細胞死亡和損傷。

 

 

這時，低溫保護劑就發揮出它的作用了。

 

低溫保護劑可保護細胞不受細胞內冰凍影響，目前多采用DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等滲透型低溫保護劑。它們的作用機制包括：自由進入細胞，取代水，使冰點下降，充當鹽的二次溶劑，提高細胞膜對水的通透性。

 

但是，部分低溫保護劑在緩慢冷凍過程中雖然會保護細胞，但它們也會引起細胞毒性，尤其是在室溫下。因此，在標準的自制凍存液中，會含有血清，血清是用來降低細胞毒性的，但血清也不是完美的。

 

血清的優勢	血清的缺點
有助于保護細胞	含有生長因子，激素等未知成分
	不推薦用于細胞庫，臨床應用
	增加污染幾率
	成本波動

 

 

如何選擇凍存液

 

 

首先我們需要明確首要任務是什么？我們的細胞需要什么？

• 高回收率？

• 高存活率？

• 注重低溫保存培養基成分？

• 需要無血清或無外源性要求？

• 商業培養基相比于自制培養基的優勢？

 

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