利用三組學聯合分析揭示多軸的抑癌機制
鱗狀細胞癌發生率約占頭頸部惡性腫瘤的90%，而口腔鱗狀細胞癌是全球頭頸部鱗狀細胞癌的主要類型，但這些惡性腫瘤的分子機制尚不清楚。因此，識別與口腔和食管鱗狀細胞癌發病機制相關的未知危險因素，將為預防和治療這些惡性腫瘤提供有效的治療策略。中國醫學科學院/北京協和醫學院劉芝華教授團隊在Cell Reports（IF 9.995）發表了題為“OTUB2 exerts tumor-suppressive roles via STAT1-mediated CALML3 activation and increased phosphatidylserine synthesis”的研究論文，該研究通過轉錄組學、蛋白組學、脂質組學以及分子生物學實驗驗證，揭示了OTUB2/STAT1/CALML3/PS軸具有抑癌作用，并顯示了PS（phosphatidylserine，磷脂酰絲氨酸）給藥作為治療和預防上消化道鱗狀細胞癌的策略的潛力。其中，中科新生命提供了轉錄組、蛋白組、代謝組的檢測和技術支持服務。
研究材料
鱗狀細胞癌小鼠模型、OTUB2敲除鱗狀細胞癌小鼠模型、人鱗狀細胞癌細胞系
技術路線
步驟1：OTUB2在正常食管上皮及食管鱗狀細胞癌組織中的表達檢測
步驟2：多組學聯合分析揭示CALML3是介導OTUB2抑癌功能的關鍵下游基因
步驟3：OTUB2/CALML3軸激活Ca2+信號通路，促進PS的合成
步驟4：OTUB2是通過介導STAT1的泛素化修飾影響磷酸化，激活CALML3轉錄
步驟5：臨床前研究提示口服磷脂酰絲氨酸抑制上消化道鱗狀細胞癌的發生
步驟2：多組學聯合分析揭示CALML3是介導OTUB2抑癌功能的關鍵下游基因
步驟3：OTUB2/CALML3軸激活Ca2+信號通路，促進PS的合成
步驟4：OTUB2是通過介導STAT1的泛素化修飾影響磷酸化，激活CALML3轉錄
步驟5：臨床前研究提示口服磷脂酰絲氨酸抑制上消化道鱗狀細胞癌的發生
研究結果
1、OTUB2抑制上消化道鱗狀細胞癌的發生
為了研究OTUB2在上消化道鱗狀細胞癌中的功能，作者首先檢測了其在正常食管上皮及食管鱗狀細胞癌（ESCC）組織中的表達情況，相較于ESCC組織，OTUB2在正常食管上皮中高表達，且預后分析表明OTUB2高表達的食管鱗狀細胞癌患者預后更好。于是，作者構建了一個OTUB2敲除ESCC小鼠模型，OTUB2敲除ESCC小鼠中發生舌瘤結節數量及ESCC發生率明顯高于野生型ESCC小鼠。接下來，作者將OTUB2敲除的上皮細胞系異種移植到小鼠體內，觀察OTUB2敲除是否可以促進人鱗狀細胞癌的發生，結果發現，OTUB2沉默的上皮細胞表現出較強的致癌能力，進一步驗證了OTUB2在上消化道鱗狀細胞癌發生中的抑癌作用。
圖1 OTUB2腫瘤抑制作用
2、 多組學聯合分析揭示CALML3是介導OTUB2抑癌功能的關鍵下游基因
作者通過轉錄組和蛋白質組學聯合分析，探討OTUB2腫瘤抑制機制。聯合分析顯示11個基因的mRNA水平和蛋白水平表現出一致的上調或下調，其中，CALML3被選擇進行進一步研究，因為據報道它在口腔和皮膚鱗狀細胞癌中下調，并作為區分肺鱗狀細胞癌和肺腺癌的重要標志物。在SCC細胞中過表達OTUB2后腫瘤的生長受到抑制，且過表達OTUB2后CALML3 mRNA和蛋白水平持續升高，而CALML3敲低消除了OTUB2對腫瘤發生的抑制。這些結果證實了CALML3是介導OTUB2腫瘤抑制功能的關鍵下游效應因子。
圖2 OTUB2通過激活CALML3來抑制SCC
3. OTUB2/CALML3軸通過控制細胞內Ca2+水平來調節PS的合成
為了確定OTUB2/CALML3抑制腫瘤作用的下游事件，對轉錄組和蛋白質組數據進行了KEGG富集分析，發現幾種脂質代謝途徑顯著富集。于是作者對小鼠腫瘤組織進行脂質組學分析，在OTUB2和CALML3表達組中甘油磷脂顯著增加，其中磷脂酰絲氨酸（PS）最為顯著，提示這可能是介導OTUB2抑癌功能的關鍵代謝事件。
鈣調素是一種多功能的Ca2+感應蛋白，通過調節靶蛋白來控制各種細胞事件。CALML3與鈣調素有85%的同源性，作者預測CALML3與鈣調素一樣，可通過感應Ca2+水平調節離子通道。研究發現，過表達OTUB2或CALML3顯著增加了細胞內Ca2+的濃度，用Ca2+通道抑制劑處理細胞后，完全消除了OTUB2或CALML3過表達引發的PS合成升高，證明OTUB2/CALML3軸通過控制細胞內Ca2+水平來調節PS的合成。
圖3 OTUB2/CALML3增加了細胞內Ca2+水平和甘油磷脂的合成
4.STAT1是介導OTUB2對CALML3轉錄激活的關鍵轉錄因子
OTUB2通過激活CALML3來抑制SCC，然而，OTUB2本身的蛋白結構沒有作為轉錄因子的特點，因此作者進一步通過質譜鑒定，鎖定了STAT1是介導OTUB2對CALML3轉錄激活的關鍵轉錄因子。
泛素化實驗證實STAT1是去泛素化酶OTUB2的直接底物，且OTUB2對STAT1的去泛素化修飾在不影響其蛋白穩定性的情況下促進了STAT1的Tyr701位點磷酸化修飾及進一步的二聚體形成。這些結果揭示了去泛素化修飾、磷酸化對轉錄因子STAT1活性的調控，隨后增強CALML3的轉錄激活。
圖4 OTUB2介導STAT1的泛素化修飾影響磷酸化
5. 口服PS可抑制腫瘤的干細胞性來阻止鱗狀細胞癌的發生
PS是細胞膜的功能成分，是神經系統的重要組成部分。PS在肉、腦組織、大豆和其他內臟器官中含量豐富。外源性PS可以跨越血腦屏障，并已被證明可以改善記憶力、注意力和學習能力。PS已被批準為世界范圍內的食品補充劑，健康補充劑。然而，補充PS是否發揮抗癌作用仍不清楚。為了進一步驗證口服PS對上消化道鱗狀細胞癌的抑制功能，作者利用鱗狀細胞癌人源腫瘤組織異種移植模型進行了臨床前研究，并發現口服PS顯著抑制了OTUB2低表達鱗狀細胞癌的發生以及增強了其對化療藥物的敏感性。這些數據證明了口服PS的靶向作用，為后續進一步探索應用PS預防及治療人類惡性腫瘤提供了重要的前期基礎。
圖5 口服磷脂酰絲氨酸抑制上消化道鱗狀細胞癌的發生
結論
本文章利用多組學整合分析系統的研究了OTUB2在上消化道鱗狀細胞癌中的重要抑癌功能，并發現該功能是通過促進轉錄因子STAT1的磷酸化及二聚體形成進而激活CALML3轉錄而實現的。其中磷脂酰絲氨酸合成增加是介導OTUB2抑癌功能的關鍵代謝事件，并且臨床前研究結果提示口服磷脂酰絲氨酸可能會為抑制上消化道鱗狀細胞癌的發生帶來幫助。
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