指標(biāo)一 

原始數(shù)據(jù)質(zhì)控
 

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)為 fastq（或?yàn)閴嚎s文件 fq.gz）格式，每個(gè)樣本有 read1.fastq.gz 和 read2.fastq.gz兩個(gè)文件，其中read1 為 barcode 和 UMI 信息，read2 為測(cè)序的 RNA 序列信息，后續(xù)根據(jù)序列標(biāo)簽信息可進(jìn)行數(shù)據(jù)拆分及定量。在數(shù)據(jù)分析過程中，我們首先需要對(duì)下機(jī)的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行一系列嚴(yán)格的質(zhì)控，去除掉低質(zhì)量數(shù)據(jù)，保留高質(zhì)量數(shù)據(jù)以確保后續(xù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果的真實(shí)性及可靠性。FastQC軟件可以快速對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行整體統(tǒng)計(jì)及質(zhì)量評(píng)估，直觀地反映出測(cè)序數(shù)據(jù)的好壞。

Q：?jiǎn)渭?xì)胞轉(zhuǎn)錄組推薦的測(cè)序數(shù)據(jù)量是多少？

答：中科使用Single Cell 3' V3.1版試劑盒，官方建議最低測(cè)序量20K reads/cell。目前，中科提供的數(shù)據(jù)量默認(rèn)為90G/樣，客戶可依據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定數(shù)據(jù)量的多少。

Q：如何判斷測(cè)序數(shù)據(jù)的好壞？

答：通過計(jì)算每個(gè)堿基的質(zhì)量值，對(duì)測(cè)序的read 進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。堿基質(zhì)量值 Q= -10×Log₁₀(P)，在生物物理學(xué)中是堿基識(shí)別出錯(cuò)概率的整數(shù)映射，用于分析每個(gè)堿基被識(shí)別錯(cuò)誤的概率，其值越高表明堿基識(shí)別越可靠。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)中的 Q20 表示該堿基錯(cuò)誤的概率為 0.01，Q30 表示錯(cuò)誤率為0.001。一般Q20在85%以上，Q30在80%以上視為測(cè)序質(zhì)量較好。
 

指標(biāo)二 

細(xì)胞過濾
 

我們?cè)谧鰡渭?xì)胞測(cè)序的時(shí)候，首先要做細(xì)胞分離。分離條件對(duì)某些類型的細(xì)胞不適應(yīng)，造成細(xì)胞破碎或凋亡，RNA溢出，導(dǎo)致線粒體基因比例上升，會(huì)干擾細(xì)胞分群。因此，在Cell Ranger 生成表達(dá)矩陣之后，還需要進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞進(jìn)行過濾。

Q：如何判定線粒體的過濾標(biāo)準(zhǔn)？

答：細(xì)胞本身就需要能量，所以必然含有一定的線粒體基因。線粒體過濾的原則為，去除線粒體基因含量過高的細(xì)胞，但不能大量丟失樣本的細(xì)胞信息。目前統(tǒng)計(jì)的文章線粒體過濾閾值在5%~30%之間不等，但是一些特殊樣本，如腫瘤組織、心臟樣本、肌肉樣本，因其本身的線粒體含量偏高，固定閾值篩選原則顯然是不合適的，故而此標(biāo)準(zhǔn)需要進(jìn)行調(diào)整。

目前，中科關(guān)于線粒體過濾采用絕對(duì)中位差（Median Absolute Deviation，MAD）。

絕對(duì)中位差是一種統(tǒng)計(jì)離差的測(cè)量。而且，MAD是一種魯棒統(tǒng)計(jì)量，比標(biāo)準(zhǔn)差更能適應(yīng)數(shù)據(jù)集中的異常值。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)差，使用的是數(shù)據(jù)到均值的距離平方，所以大的偏差權(quán)重更大，異常值對(duì)結(jié)果也會(huì)產(chǎn)生重要影響。對(duì)于MAD，少量的異常值不會(huì)影響最終的結(jié)果。且MAD是一個(gè)比樣本方差或者標(biāo)準(zhǔn)差更魯棒的度量，對(duì)于不存在均值或者方差的分布效果更好。

 

指標(biāo)三 

多樣本批次矯正
 

當(dāng)涉及多個(gè)樣本進(jìn)行比較分析時(shí)，需要對(duì)這些樣本進(jìn)行合并分析和批次矯正。目前，中科采用 Harmony 方法對(duì)scRNA 數(shù)據(jù)進(jìn)行多樣本合并和批次效應(yīng)的校正。
 

圖1 Harmony原理圖
 

Harmony原理：利用PCA將轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜嵌入到低維空間中，不同顏色表示不同數(shù)據(jù)集，不同形狀表示不同的細(xì)胞類型，然后應(yīng)用迭代過程去除數(shù)據(jù)集特有的影響。

A. Harmony概率性地將細(xì)胞分配給cluster，從而使每個(gè)cluster內(nèi)數(shù)據(jù)集的多樣性最大化；

B. Harmony計(jì)算每個(gè)cluster的所有數(shù)據(jù)集的全局中心，以及特定數(shù)據(jù)集的中心；

C. 在每個(gè)cluster中，Harmony基于中心為每個(gè)數(shù)據(jù)集計(jì)算校正因子；

D. 最后，Harmony使用基于C的特定于細(xì)胞的因子校正每個(gè)細(xì)胞。由于Harmony使用軟聚類，因此可以通過多個(gè)因子的線性組合對(duì)其A中進(jìn)行的軟聚類分配進(jìn)行線性校正，來(lái)修正每個(gè)單細(xì)胞。

重復(fù)步驟A到D，直到收斂為止。聚類分配和數(shù)據(jù)集之間的依賴性隨著每一輪的減少而減小。

Harmony算法與其他整合算法相比的優(yōu)勢(shì)：

（1）整合數(shù)據(jù)的同時(shí)對(duì)稀有細(xì)胞的敏感性依然很好；

（2）適合于更復(fù)雜的單細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可以比較來(lái)自不同供體，組織和技術(shù)平臺(tái)的細(xì)胞。

總結(jié)

本期分享到這里就結(jié)束啦，通過這三期Q&A內(nèi)容的學(xué)習(xí)，相信各位老師對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組已經(jīng)有了比較深入的了解，以及如何將單細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于自己的課題也有了明確的方向。中科新生命單細(xì)胞多組學(xué)相關(guān)產(chǎn)品持續(xù)熱銷中，歡迎感興趣的老師前來(lái)咨詢。
 

參考文獻(xiàn)

[1] Korsunsky I , Fan J , Slowikowski K , et al. Fast, sensitive, and flexible integration of single cell data with Harmony[J]. Cold Spring Harbor Laboratory, 2018(12).
 

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