老年性耳聾(ARHL)是老年人中最常見的感覺障礙。目前，沒有治療方法可以有效預防或逆轉ARHL。老化的聽覺器官通常伴隨著氧化應激和代謝惡化的加劇。隨著人口老齡化，ARHL的發(fā)病率增高，目前已經成為老年人中三大最常見慢性病之一。
 

9月22日，國際知名期刊 Redox Biology（IF 10.787）在線發(fā)表了上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院楊軍教授課題組題為“Dietary intake of deuterium oxide decrases cochlear metabolism and oxidative stress levels in a mouse model of age-related hearing loss ”的研究文章。文章主要采用代謝流技術研究了重水（D₂O）對ARHL小鼠模型的影響，結果發(fā)現D₂O補充劑可以通過減緩新陳代謝速度和減少耳蝸中的內源性氧化應激的產生來阻礙小鼠模型中ARHL的進展。這些發(fā)現為保護耳蝸免受氧化應激和調節(jié)新陳代謝以預防ARHL 開辟了新的途徑。中科新生命為本研究提供了代謝流檢測服務。

 
研究材料

DBA/2J 、CBA/CaJ和C57BL/6J小鼠模型的耳蝸

 技術路線

步驟1：膳食 D₂O 補充劑可改善 DBA/2J 小鼠的ARHL和保護耳蝸毛細胞；

步驟2：膳食D₂O補充劑可減少耳蝸中的內源性氧化應激；

步驟3：D₂O可減緩分解代謝反應，并可能延緩與衰老有關的代謝過程；

步驟4：D₂O可以改善 C57BL/6J 和 CBA/CaJ 小鼠模型中的 ARHL，并減少耳蝸中的內源性氧化應激。

 研究結果

1. 膳食D₂O補充劑可改善DBA/2J小鼠的ARHL和保護耳蝸毛細胞

研究者使用實驗小鼠（使用的三種小鼠品系DBA/2J、C57BL/6J 和 CBA/ CaJ）從出生后第4周到第9周用10%D₂O處理，測量了小鼠飲用水量和小鼠體重，以確定每日D₂O處理對體重的影響。與對照組小鼠相比，處理組小鼠的飲水量和體重沒有顯著差異；通過分析4周齡、9周齡、20周齡和40周齡在4至32kHz頻率范圍內對純音刺激的聽性腦干反應（ABR）來估計聽力閾值（HT），DBA/ 2J小鼠表現出早發(fā)性(4周)，進行性，高頻(>16 kHz)聽力損失 。在9周時，DBA / 2J小鼠的聽力水平與4周相比顯著升高。DBA/2J 處理小鼠在9周齡時測得的HT在8、11和16 kHz時顯著低于對照小鼠各自頻率的HT，這些發(fā)現與處理組和對照組小鼠耳蝸基部感覺上皮中外毛細胞（OHC）存活率的顯著差異相關。

圖1 實驗過程中的飲水量和體重變化

圖2 膳食D₂O補充劑對DBA / 2J小鼠聽力的影響
 

2. 膳食D₂O補充劑可減少耳蝸中的內源性氧化應激

4-HNE（4-羥基壬烯醛）是脂質過氧化的高活性副產物，被廣泛認為是氧化應激標志物，可能觸發(fā)氧化應激的細胞毒性作用。為了確定膳食D₂O補充劑是否影響耳蝸中的氧化應激水平，對用抗4-HNE抗體免疫標記的固定耳蝸切片進行了共聚焦熒光成像 。研究表明NRF2/ARE/HO-1軸對噪聲引起的耳蝸氧化損傷具有保護作用。在9周年齡，與對照組小鼠相比，處理組中NRF2 和HO-1蛋白質的表達水平顯著降低，并且在 DBA / 2J小鼠的螺旋神經元（SGNs），柯蒂氏器（Co）和血管紋（SV）中也顯著降低。與DBA / 2J小鼠中各自的對照組相比，處理組中SGNs，Co和SV中的谷胱甘肽化蛋白水平降低。結果表明，膳食D2O補充劑降低了內源性ROS水平，從而減少了對NRF2依賴性保護機制的需求。

圖3 膳食D₂O補充劑對DBA / 2J小鼠耳蝸脂質過氧化的影響


圖4 膳食D₂O補充劑對DBA / 2J，C57BL / 6J和CBA / CaJ小鼠耳蝸中Nrf2表達的影響


圖5 膳食D₂O補充劑對DBA / 2J，C57BL / 6J和CBA / CaJ小鼠耳蝸中HO-1表達的影響

圖6 膳食D₂O補充對DBA / 2J，C57BL / 6J和CBA / CaJ小鼠耳蝸中谷胱甘肽化蛋白表達的影響

3.  D₂O可減緩分解代謝反應，并可能延緩與衰老有關的代謝過程

通過內耳代謝流分析，比較了不同底物的代謝，包括25種氨基酸和參與糖酵解和三羧酸循環(huán)的關鍵中間產物。結果顯示部分代謝物在處理組和對照組的耳蝸中差異表達。其中八種氨基酸（Lys、Cys、Pro、L-Argsuc、cytine、Val、Asn和Gly）在處理小鼠中1H和D均顯著增加。只有Asp在處理小鼠中顯示1H和D減少。葡萄糖代謝中，共檢測出18種糖酵解和三羧酸循環(huán)的關鍵中間產物:處理組小鼠中葡萄糖、乳酸、3 PG、SUC、PYR和AKC顯示1H不變，D增加；F6P和DHAP顯示1H保持不變，D降低 。總之，代謝流分析表明，D₂O主要減緩涉及葡萄糖和氨基酸的分解代謝反應，因此可能在一定程度上延緩與衰老相關的代謝惡化。

圖7 膳食D₂O補充劑對DBA / 2J小鼠耳蝸代謝水平的影響


圖8 膳食D₂O補充劑對DBA / 2J小鼠耳蝸中葡萄糖代謝和三羧酸循環(huán)(TCA)的影響


圖9 膳食D₂O補充劑對DBA / 2J小鼠耳蝸氨基酸代謝的影響
 

4. D₂O可以改善 C57BL/6J 和 CBA/CaJ 小鼠模型中的 ARHL，并減少耳蝸中的內源性氧化應激 

研究者使用另外兩種ARHL小鼠模型(C57BL / 6J小鼠和CBA / CaJ小鼠)來研究D₂O對ARHL進展的影響。從4周齡開始使用10%的D₂O膳食補充劑，在C57BL / 6J和CBA / CaJ小鼠的耳蝸中，與對照小鼠相比，用作內源性ROS標志物的4-HNE在處理組小鼠的耳蝸中明顯減少。另一方面，免疫印跡和免疫熒光數據顯示，與對照組耳蝸相比，處理組耳蝸中 Nrf2，HO-1和谷胱甘肽的表達均降低。Nrf2/HO-1途徑和谷胱甘肽代謝途徑也受到抑制。這些結果表明， D₂O可能會改善不同類型的ARHL。

小結

ARHL是一種具有多種因素的復雜疾病，研究者報告了膳食添加D₂O抑制了內源性氧化應激的產生，減少了Nrf2/HO-1/谷胱甘肽軸的激活。代謝流分析表明D₂O減緩了葡萄糖和氨基酸等營養(yǎng)物質的消耗，并在一定程度上延緩與衰老有關的代謝過程。D₂O補充劑可以通過減緩內耳代謝速度和減少內源性氧化應激的產生來減少小鼠模型中ARHL的進展。抗氧化基因表達的降低表明，D₂O可能繞過Nrf2/HO-1/谷胱甘肽軸，直接抑制耳蝸內部ROS的產生，最終減少ARHL小鼠的聽力障礙。本研究為ARHL的臨床治療提供了新的思路。