研究材料

小鼠肝臟組織、血清、尿液、小鼠原代肝細胞、AML12細胞、HepG2細胞

 技術路線

步驟1：在NAFLD小鼠模型中，肝組織中MUP蛋白顯著減少；

步驟2：在內質網應激下，肝細胞中MUP1蛋白表達和分泌減少；

步驟3：MUP1刺激肝細胞中的內質網鈣流出并誘導急性內質網應激反應；

步驟4：MUP1干預能夠引起肝細胞預適應于內質網應激，進而緩解藥物引起的內質網應激及內質網應激引起的胰島素抵抗。

 研究結果

1.  NAFLD小鼠肝臟中MUP蛋白減少

生理指標檢測結果發現NAFLD小鼠表現出體重過度增加、肝臟與體重和脂肪與體重的比率增加，以及肝臟甘油三酯含量顯著增加。為了進一步探討NAFLD小鼠肝臟內蛋白質的變化，作者采用了蛋白質組學分析，結果顯示NAFLD小鼠的多種MUP亞型的顯著下降，其中MUP1亞型可能對代謝貢獻最大。這些數據表明MUPs，尤其是MUP1，可能是參與NAFLD代謝調節的重要因子。

圖1 NAFLD小鼠生理指標及蛋白組檢測

2. NAFLD小鼠肝臟內質網應激反應受損

KEGG分析顯示，“內質網中的蛋白質加工”途徑顯著豐富。NAFLD小鼠中，未折疊蛋白應答（UPR）和內質網相關蛋白降解（ERAD）途徑的表達模式發生了明顯改變。且WB結果顯示，在NAFLD小鼠的肝臟中，IRE1α和PERK的水平顯著增加，而p-eIF2α、ATF4和BiP的水平顯著降低，這表明在代謝紊亂和肝臟內質網應激反應中UPR信號失調導致內質網負擔增加。這些數據表明，在NAFLD小鼠模型中，肝臟內質網應激反應受損 。  
 

圖2 NAFLD小鼠功能通路分析

 

3.  內質網應激下肝細胞MUP1的表達降低

接下來，作者將NAFLD小鼠和對照小鼠腹腔注射衣霉素（Tm，一種內質網應激誘導劑）或等量DMSO以建立肝臟內質網應激小鼠模型，蛋白質檢測結果顯示MUPs的水平在肝臟內質網應激模型中顯著降低。WB分析證實了MUP1在肝臟中的類似表達模式。因此，MUPs被鑒定為代謝和內質網應激反應蛋白，這表明MUPs可能是NAFLD中內質網應激和代謝的潛在聯系。

圖3 肝細胞中MUP的表達模式

 

4. 內質網應激誘導肝細胞內質網中MUP1聚集

為了解決MUP1響應內質網應激而降低的機制，對肝臟切片進行免疫熒光染色以確定MUP1在肝臟中的分布。共聚焦顯微鏡分析顯示，與對照小鼠相比，MUP1保留在Tm小鼠的肝細胞內質網中。進一步表明內質網應激下MUP1在內質網中的滯留增加，這部分解釋了細胞中成熟MUP1的減少。

圖4 MUP1在肝臟中的分布

 

5. MUP1刺激肝細胞內質網中鈣離子外流并誘導急性內質網應激

用MUP1處理原代肝細胞并進行RNA測序，GSEA分析顯示，“鈣信號通路”顯著富集（圖5B）。由于鈣穩態對內質網穩態和細胞命運至關重要，因此，作者推測MUP1作為內質網應激反應蛋白，可能通過反饋參與內質網應激的調節。為了進一步研究MUP1對肝臟內質網應激的影響，用毒胡蘿卜素（thapsigargin，Tg）作為調節Ca²⁺濃度的陽性對照。結果顯示，MUP1處理瞬時刺激內質網應激途徑。值得注意的是，MUP1對內質網應激的影響與Tg相似，表明MUP1對Ca²⁺穩態的潛在作用。而在無Ca²⁺溶劑中用MUP1處理，Ca²⁺從ER流出，顯著增加了胞漿Ca²⁺濃度。這些數據表明，MUP1刺激肝細胞中的內質網鈣離子外流并誘導急性內質網應激反應。
 

圖4 MUP1在肝臟中的分布

 

5. MUP1刺激肝細胞內質網中鈣離子外流并誘導急性內質網應激

用MUP1處理原代肝細胞并進行RNA測序，GSEA分析顯示，“鈣信號通路”顯著富集（圖5B）。由于鈣穩態對內質網穩態和細胞命運至關重要，因此，作者推測MUP1作為內質網應激反應蛋白，可能通過反饋參與內質網應激的調節。為了進一步研究MUP1對肝臟內質網應激的影響，用毒胡蘿卜素（thapsigargin，Tg）作為調節Ca²⁺濃度的陽性對照。結果顯示，MUP1處理瞬時刺激內質網應激途徑。值得注意的是，MUP1對內質網應激的影響與Tg相似，表明MUP1對Ca²⁺穩態的潛在作用。而在無Ca²⁺溶劑中用MUP1處理，Ca²⁺從ER流出，顯著增加了胞漿Ca²⁺濃度。這些數據表明，MUP1刺激肝細胞中的內質網鈣離子外流并誘導急性內質網應激反應。

圖5 MUP1對肝臟內質網應激的影響

 

6. MUP1預處理抑制蛋白質合成并減輕肝細胞內質網應激和胰島素抵抗

為了進一步研究MUP1在短暫刺激內質網應激中的生理意義，將原代肝細胞用MUP1預處理后用Tm處理誘導應內質網應激。WB和轉錄組結果表明，Tm顯著增加了內質網應激標志物的蛋白質水平，包括GADD34、ATF4、CHOP、XBP1s和p-eIF2α，而MUP1預處理可抑制ER應激。接下來，作者評估了抑制肝臟內質網應激對胰島素反應的影響。MUP1預處理細胞受到內質網應激時，Akt顯著增強，內質網應激標記物顯著減弱，這表明胰島素敏感性和肝內質網應激得到改善。該數據表明，MUP1預處理在體外減輕了肝臟內質網應激和內質網應激誘導的胰島素抵抗。

圖6 MUP1預處理減輕了肝細胞內質網應激和胰島素抵抗

7. MUP1預處理減輕Tm誘導的肝臟內質網應激

為了評估MUP1在體內的病理生理作用，用MUP1預處理小鼠然后腹腔注射Tm以建立急性內質網應激模型，Tm處理導致明顯的肝臟甘油三酯積聚和空泡化，MUP1預處理組有所改善，結果表明MUP1預處理減輕了Tm誘導的過度肝臟脂肪變性。同時，作者還研究了腎臟中的內質網應激反應。有趣的是，MUP1預處理顯著減輕了Tm誘導的腎內質網應激，這表明MUP1對體內內質網應激反應的影響 。

圖7 MUP1在體內的病理生理作用

 
小編小結

在這項研究中，作者提供了肝臟MUPs顯著降低導致內質網應激受損的證據。MUP1作為MUP家族中最豐富的成員，由內質網合成和加工，它受到內質網應激的負調節。從機制上講，肝臟內質網應激導致MUP1形成聚集體并被困在內質網中，從而減少MUP1的分泌。此外，在肝細胞中補充重組MUP1增加了內質網鈣離子外流至胞漿中，并短暫誘導預適應內質網應激，這有助于肝細胞通過抑制蛋白質合成來減輕化學誘導的內質網應激和內質網應激誘導的胰島素抵抗，表明NAFLD的潛在治療靶點。