血管老化不僅是人體衰老的始發關鍵因素，而且還是動脈粥樣硬化等血管性疾病的共同病理基礎。當長期暴露于心血管疾病危險因素中，血管內皮細胞呈現早熟性應激性衰老表型。近年來，內皮細胞的物質代謝，尤其是脂肪酸代謝，其病理生理意義越來越受到重視，但是內皮細胞脂肪酸代謝與內皮細胞衰老之間的關系尚不清楚。

2022年8月，中山大學李卓明教授研究團隊在Oxidative Medicine and Cellular Longevity（IF 7.31）期刊上發表了題為“Disturbance of Fatty Acid Metabolism Promoted Vascular Endothelial Cell Senescence via Acetyl-CoA-Induced Protein Acetylation Modification”的文章，該文章利用乙酰化修飾組學和代謝組學等方法揭示了衰老內皮細胞中脂肪酸代謝的變化以及脂肪酸代謝在內皮衰老中的潛在調節機制，即脂肪酸代謝紊亂通過蛋白質乙酰化修飾促進血管內皮細胞的衰老。該研究為血管衰老及相關心血管疾病提供了靶向內皮細胞代謝的治療策略。中科新生命為該研究提供了乙酰化修飾蛋白質組學和代謝組學技術服務。

 研究材料

H₂O₂誘導的內皮細胞衰老模型、細胞傳導培養誘導的復制性內皮細胞衰老模型、自發性高血壓大鼠和Ang II輸注小鼠內皮衰老動物模型

 技術路線

步驟1：內皮細胞衰老伴有脂肪酸代謝抑制；

步驟2：衰老內皮細胞中脂肪酸代謝相關酶的表達水平降低；

步驟3：CPT1A依賴的LCFA代謝可阻抑內皮細胞衰老；

步驟4：補充短鏈脂肪酸在體外和體內均對內皮細胞的衰老有挽救作用；

步驟5：脂肪酸代謝通過乙酰輔酶A調節內皮細胞衰老；

步驟6：衰老內皮細胞中乙酰化蛋白譜發生改變。

 研究結果

1. 內皮細胞衰老伴有脂肪酸代謝抑制

在本研究中，通過檢測H₂O₂誘導的內皮細胞衰老和細胞傳導培養誘導的復制性內皮細胞衰老中棕櫚酸基耗氧率(OCR)，研究脂肪酸代謝。結果表明，在內皮細胞衰老過程中，脂肪酸代謝下降（圖1a-1d）。此外，通過代謝組學發現，在衰老內皮細胞中大部分中、長鏈脂肪酸、飽和及不飽和脂肪酸、亞油酸甲酯和二十二碳六烯酸(DHA)、TCA周期相關有機酸代謝產物、FAO（脂肪酸氧化）的代謝產物乙酰輔酶A在衰老內皮細胞中均有所下降，NAD/NADH升高(圖1e和1f)。綜上所述，脂肪酸代謝紊亂與內皮細胞衰老有關。

圖1 內皮細胞衰老伴有脂肪酸代謝抑制

2. 衰老內皮細胞中脂肪酸代謝相關酶的表達水平降低

為了探索脂肪酸代謝異常的可能機制，作者研究了衰老內皮細胞中脂肪酸攝取、轉運和β-氧化相關蛋白的mRNA表達。結果表明與脂肪酸攝取相關的脂肪酸轉運蛋白(FATP) 6、與轉運相關的肉堿棕櫚酰轉移酶1 (CPT1)、肉堿棕櫚酰轉移酶2 (CPT2)均明顯減少。這些結果表明，與脂肪酸攝取和線粒體進入相關的蛋白的下調抑制了內皮細胞衰老過程中的脂肪酸代謝。作者進一步深入研究了CPT1A（內皮細胞中高表達的CPT1亞型）蛋白的表達，結果表明在細胞水平（體外）和內皮衰老動物模型（體內）中，CPT1A的表達均明顯減少，即表明CPT1A在內皮細胞衰老過程中受到抑制（圖2）。

圖2 衰老內皮細胞中脂肪酸代謝相關酶CPT1A的表達水平顯著下調

3.  CPT1A依賴的LCFA代謝可防止內皮細胞衰老

CPT1A被認為是內皮細胞中LCFA(長鏈脂肪酸)氧化的限速酶，因此衰老內皮細胞中CPT1A的下降可能通過抑制CPT1A依賴的LCFA從而導致內皮細胞衰老。為了驗證這一假設，作者采用CPT1A siRNA、CPT1A抑制劑依托莫昔(ETO)和過表達CPT1A的方式研究內皮細胞衰老的機制。結果表明CPT1A的抑制（siRNA、ETO處理）增加了衰老細胞的比例、上調細胞周期因子的表達、降低增殖細胞的比例（圖3a-3c），過表達CPT1A則逆轉了上述現象（圖3d-3f）。綜上所述，CPT1A依賴的LCFA代謝可以防止內皮細胞衰老，抑制CPT1A可促進內皮細胞衰老。
 

圖3 CPT1A依賴的LCFA代謝可防止內皮細胞衰老

4. 補充短鏈脂肪酸在體外和體內均對內皮細胞的衰老有挽救作用

與LCFAs不同，SCFAs（斷鏈脂肪酸）不依賴于CPT1進入線粒體，為線粒體氧化途徑補充脂酰。因此，在本研究中加入乙酸或丙酸（短鏈脂肪酸）研究CPT1A非依賴的SCFAs是否能夠改善內皮細胞衰老。體外結果表明乙酸和醋酸均具有明顯的抗衰老作用（圖4a-c、圖5），醋酸在體內實驗中也顯著改善了內皮層的衰老（圖4d-4g）。

圖4 補充短鏈脂肪酸在體內外均對內皮細胞的衰老有挽救作用

圖5 補充短鏈脂肪酸對CPT1A受抑引起的內皮細胞衰老有挽救作用

5. 脂肪酸代謝通過乙酰輔酶A調節內皮細胞衰老

由于乙酰輔酶A是脂肪酸代謝的最終產物，因此內皮衰老過程中CPT1A依賴的LCFA氧化的減少可導致乙酰輔酶A水平改變（圖6a和6b）。由此推測乙酰輔酶A在內皮細胞衰老中的發揮重要作用，因此作者使用了乙酰輔酶A的抑制劑-ATP檸檬酸裂解酶(ACLY)抑制進行驗證。結果表明乙酰輔酶A水平的降低可加劇內皮細胞的衰老（圖6c-6f），乙酸和醋酸則逆轉內皮細胞衰老（圖6d-6f）。
 

圖6 脂肪酸代謝通過乙酰輔酶A調節內皮細胞衰老

6. 衰老內皮細胞中乙酰化蛋白譜發生改變

由于乙酰輔酶A參與了內皮細胞衰老的調控，而乙酰輔酶A是賴氨酸乙酰化的主要乙酰基供體，由此推測乙酰輔酶A可能影響內皮細胞衰老過程中蛋白質乙酰化修飾。為了驗證這一假設，作者開展了乙酰化修飾組學。此次共鑒定到2706個乙酰化蛋白，其中有43個乙酰化賴氨酸位點的40個蛋白質在衰老細胞中乙酰化水平顯著降低（圖7b-7d）, KEGG通路分析顯示這些蛋白與細胞能量代謝、細胞周期密切相關（圖7e）。綜上所述，CPT1A依賴的脂肪酸代謝缺陷導致乙酰輔酶A缺失，導致蛋白質乙酰化被抑制，進而加劇細胞代謝，抑制細胞周期，最終導致內皮細胞衰老。

圖7 衰老內皮細胞中乙酰化蛋白譜發生改變

小編小結

本項研究中，作者采用代謝組學、乙酰化修飾組學等方式揭示了內皮細胞代謝與內皮細胞衰老之間的關系。即在衰老的內皮細胞中脂肪酸氧化(FAO)被抑制，脂肪酸譜被擾亂，CPT1A蛋白的表達顯著降低。在機制上，脂肪酸代謝通過乙酰輔酶A調節內皮細胞的衰老。此外，通過補充短鏈脂肪酸或乙酰輔酶A可以防止內皮細胞的衰老。這些發現提示改善脂肪酸代謝可能改善內皮細胞衰老相關的心血管疾病。