由細菌性病原體結核分枝桿菌(MTB)引起的結核病(TB)是一個主要的全球衛生問題，每年造成150萬人死亡。當病原體進入肺部時，細菌和宿主間產生的相互作用會誘導組織重塑，產生慢性炎癥病變，即肉芽腫。肉芽腫是結核病的病理標志，然而它們的功能和形成機制仍然知之甚少。

哈佛大學公共衛生學院免疫與傳染病學系Eric J. Rubin教授團隊，以“Inflammatory signaling in human tuberculosis granulomas is spatially organized”為題在線發表于Nature Medicine（IF 87.241）。該研究團隊通過以空間蛋白質組學、空間代謝組學為核心的空間多組學技術，揭示了在肉芽腫形成過程中，其炎癥信號的空間定位信息及結核病疾病發生機理，為結核病臨床研究提供了理論依據。

 研究材料

人結核肉芽腫組織、兔結核肉芽腫組織

 技術路線

步驟1：建立人類肉芽腫中蛋白質表達空間解析圖；

步驟2：篩選不同肉芽腫樣本中的差異蛋白；

步驟3：空間代謝組學檢測肉芽腫；

步驟4：探究肉芽腫病灶區促炎反應；

步驟5：探究肉芽腫周圍活性組織的抗炎癥反應。

 研究結果

1. 建立人類肉芽腫中蛋白質表達空間解析圖

作者使用來自多個個體的肺樣本以及來自同一肺不同分化階段的肉芽腫，根據組織學將這些病變分為固體肉芽腫、干酪樣肉芽腫和空洞性肉芽腫，并通過空間蛋白質組學進行分析。首先使用激光顯微切割技術（LCM）分別提取出實性肉芽腫活性組織，干酪樣肉芽腫和空腔肉芽腫的活性組織，以及干酪樣肉芽腫和空腔肉芽腫的壞死組織，然后采用Label free方法對這5種樣本的蛋白質組進行分析，共鑒定到4406個蛋白，并以此建立了人類肉芽腫中蛋白質表達的空間解析圖。

圖1 空間蛋白質組學分析肉芽腫蛋白表達圖譜

2. 篩選不同肉芽腫樣本中的差異蛋白

作者通過分析肉芽腫的蛋白質組學數據，發現肉芽腫內部的變異遠遠多于肉芽腫亞型之間的變異。PCA分析及聚類結果表明，無論肉芽腫切除的病變類型如何，其活性區域都聚集在一起，壞死區域同樣如此。接著作者對得到的差異蛋白進行GO和 KEGG富集分析，發現具有顯著差異的功能蛋白主要參與炎癥和抗微生物過程。值得注意的是，參與產生促炎二十烷類的蛋白質在壞死區域中也更豐富。此外，代謝花生四烯酸（AA）的蛋白質，包括ALOX5, ALOX5AP和LTA4H，在壞死組織區域中顯著富集。這些結果表明AA的產物、結核感染期間炎癥的關鍵介質二十烷類可能發揮重要作用。

圖2 不同肉芽腫樣本中差異蛋白的分布情況

3. 空間代謝組學檢測肉芽腫AA

作者使用免疫組化（IHC）和共聚焦顯微鏡來定位多個參與含AA溶血磷脂生產的磷脂酶，發現大多數在整個肉芽腫中彌漫性表達。雖然生物合成酶的存在表明它們的最終產物可能會積累，但酶的豐度和其產物可能并不相關。因此作者使用空間代謝組學技術直接測量AA的豐度，對人類活性、干酪性和空洞性肉芽腫中的AA和AA前體進行了成像，發現它們的豐度模式與空間蛋白質組學分析確定的代謝AA的蛋白質表達一致。結果表明，正常肺組織中很少檢測到AA，但整個肉芽腫中都有AA合成，且在壞死組織邊緣富集。此外，兔活性組織和壞死組織的空間代謝成像顯示了與人類肉芽腫相似的AA分布模式。

圖3 空間代謝組學檢測肉芽腫中AA豐度

4. 探究肉芽腫病灶區促炎反應

研究表明AA可以進入促炎或抗炎通路。白三烯A4水解酶(LTA4H)是代謝AA的蛋白質，作為一種促炎二十烷類，其能夠促進炎癥反應的發生，且與TNF-α的產生有關。蛋白質組學結果表明，LTA4H在壞死組織區域顯著富集。IHC結果顯示，空洞肉芽腫病變組織和干酪肉芽腫病變組織邊緣有較多的LTA4H，而在實性肉芽腫中幾乎沒有LTA4H。此外，TNF-α在實體肉芽腫中含量相對較低，但在干酪性肉芽腫和空洞樣肉芽腫的壞死邊緣含量較高。值得注意的是，IHC的結果表明TNF-α與LTA4H具有相似的分布，共定位約為85.3%。同樣的結果在兔子的實性和干酪性病變樣本中得到了重現。這些結果說明空間LTA4H介導的促炎反應與TNF-α的產生有關。

圖4 白三烯生物合成在壞死和直接毗鄰壞死組織的細胞層中富集
 

圖5 TNF-α和LTA4H在壞死組織及其邊緣更為豐富

5. 肉芽腫周圍活性組織的抗炎癥反應研究

與壞死肉芽腫的中心相反，在肉芽腫周圍發現的細胞中含有更多的抗炎蛋白質組學特征，即抗炎調節劑和還原劑在肉芽腫周圍富集。在二十烷類通路中，前列腺素合成可緩和結核病變中的炎癥。負責前列腺素合成的酶，即環氧化酶1和2 (COX1/2)，在實體肉芽腫中富集，與該肉芽腫整體炎癥較輕的特征一致。

通過LC-MS靶向代謝組學數據分析前列腺素濃度，發現它們在活性組織中表達更豐富。在空洞性肉芽腫和干酪樣肉芽腫中，作者發現COX1和COX2在活性組織層中廣泛表達，但在壞死的干酪性區域中基本不表達，這與LTA4H豐度的模式形成對比。此外，雖然LTA4H在巨噬細胞亞群中特異性表達，但作者發現COX1/2在巨噬細胞和成纖維細胞中均有表達。在兔組織中，相比于TNF-α和LTA4H，COX1/2在活性組織區域更豐富，而在壞死的干酪性區域中較少，這與在人類組織中的觀察結果相同。因此，各種二十烷類化合物(白三烯)的相對豐度表明，肉芽腫的高度促炎中心被緩和炎癥的分子包圍，包括COX1/2通路的一些前列腺素，可以緩解炎癥。

圖6 COX1/2在所有肉芽腫區域廣泛表達

 小結

該文章通過空間蛋白質組學、空間代謝組學等研究方法，繪制了人類肉芽腫的空間分子圖譜。研究結果表明，肉芽腫中心具有以抗微生物、ROS和二十烷類特征的促炎環境。相反，肉芽腫周圍的活性組織具有相對抗炎的特征，且肉芽腫內不同種類的區域之間有獨特的分子特征。盡管此結果需要在更大的樣本集中得到證實，但本文的研究數據表明，真正的平衡發生在局部，系統性干預可能相當復雜。

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