用代謝組揭示耐寒蠟樣芽孢桿菌D2對Ni (II)毒性的響應機制
Ni (II) 廣泛應用于工業生產領域，然而過量的Ni (II)會影響人類、動物和植物的健康。先前研究發現耐寒蠟樣芽孢桿菌D2可以在低溫條件下修復Ni (II)污染土壤，但其對Ni (II)的抗性較低。2022年5月，吉林農業大學李明堂教授團隊發表在Journal of Hazardous Materials (IF 14.224)雜志上發表了題為“Response mechanism of psychrotolerant Bacillus cereus D2 towards Ni (II) toxicity and involvement of amino acids in Ni (II) toxicity reduction”的研究成果，采用非靶向代謝組學，結合傳統方法對不同濃度Ni (II)處理的耐寒蠟樣芽孢桿菌D2進行了響應機制研究，發現Ni (II)影響菌株D2的氨基酸和ABC轉運蛋白的生物合成，添加氨基酸可恢復其生長，為減輕Ni (II)對菌株D2的毒性提供了思路，有助于開發對Ni (II)毒性更耐受的生物修復菌株。中科新生命提供了非靶向代謝組學檢測服務。
研究材料
耐寒蠟樣芽孢桿菌D2
技術路線
耐寒蠟樣芽孢桿菌D2
技術路線
步驟1：pH值和Ni (II)對菌株D2生長的影響；
步驟2：Ni (II)對菌株D2形態結構和ROS的影響；
步驟3：Ni (II)對菌株D2細胞周期的影響；
步驟4：Ni (II)對菌株D2代謝組的影響；
步驟5：外源添加氨基酸對Ni (II)處理菌株D2生長的影響。
步驟2：Ni (II)對菌株D2形態結構和ROS的影響；
步驟3：Ni (II)對菌株D2細胞周期的影響；
步驟4：Ni (II)對菌株D2代謝組的影響；
步驟5：外源添加氨基酸對Ni (II)處理菌株D2生長的影響。
研究結果
菌株D2在pH 6-8范圍內表現出良好的生長速率，最適pH值為7。初始濃度為60 mg/L的Ni (II)抑制了50%的D2菌株生長，而100 mg/L的Ni (II)幾乎完全抑制D2菌株的生長。
圖1 pH值和Ni (II)對菌株D2生長的影響
2. Ni (II)對菌株D2形態結構和ROS的影響
掃描電鏡(SEM)分析顯示，初始Ni (II)濃度為60 mg/L時，菌體細胞膜完整性發生變化，出現輕微的皺縮；濃度為100 mg/L時，膜表面出現部分損傷和褶皺，細胞呈腫脹形態。表明，隨著Ni (II)濃度的增加，細菌膜損傷程度和細菌腫脹程度增加。
圖2 Ni (II)對菌株D2形態結構的影響
與對照組相比，初始濃度為60和100 mg/L的Ni (II)處理組菌株的乳酸脫氫酶(LDH)活性和ROS顯著增加，表明Ni (II)對菌株D2的毒性作用部分是由細胞膜損傷和ROS的產生引起的。
圖3 Ni (II)對菌株D2 ROS產生的影響
3. Ni (II)對菌株D2細胞周期的影響
qRT-PCR分析顯示，在初始濃度為60和100 mg/L的Ni (II)處理組中，細胞周期相關調控基因mesJ、dnaA、ftsZ和ftsA顯著下調，表明Ni (II)毒性可以導致菌株D2的細胞周期失調。
圖4 Ni (II)對菌株D2細胞周期的影響
4. Ni (II)對菌株D2代謝組的影響
采用非靶向代謝組學方法對初始Ni (II)濃度為0、60和100 mg/L處理的菌株D2進行分析，主成分分析(PCA)顯示，與對照組相比，初始Ni (II)濃度為60和100 mg/L的處理組變化顯著，表明Ni (II)顯著影響了菌體D2的代謝穩態。對差異代謝物進行通路分析，發現差異代謝物主要參與氨基酸和ABC轉運蛋白的生物合成途徑。
圖5 Ni (II)對菌株D2代謝通路的影響
在氨基酸合成通路中，共有七個氨基酸發生了顯著變化，其中天冬酰胺(Asp)、蛋氨酸(Met)和瓜氨酸(Cit)的相對豐度隨Ni (II)濃度的增加而降低，而賴氨酸(Lys)、谷氨酸(Glu)、異亮氨酸(IIe)和組氨酸(His)的相對豐度隨Ni (II)濃度的增加而升高。
圖6 Ni (II)對菌株D2代謝物的影響
5. 外源添加氨基酸對Ni (II)處理菌株D2生長的影響
在初始Ni (II)濃度為60或100 mg/L處理的細胞中分別添加5或20 mM的7種氨基酸，發現除谷氨酰胺外，初始Ni (II) 濃度為60 mg/L的處理細胞中加入5或20 mM的氨基酸后生長顯著增強；初始Ni (II) 濃度為100 mg/L處理細胞中加入20 mM Glu、IIe、His、Met、Asp或5 mM His、Asp后生長顯著增強。表明His、Met和Asp在菌株D2抵抗Ni (II)毒性方面具有直接作用。
圖7 外源添加氨基酸對Ni (II)處理菌株D2生長的影響
小結
Ni (II)毒性嚴重影響菌株D2的生長、形態、細胞周期和代謝產物。代謝組學研究發現氨基酸合成的變化與Ni (II)對菌株D2的毒性有關。外源添加Glu、IIe、His、Met和Asp可以緩解Ni對菌株D2細胞的毒性，說明氨基酸在提高菌株對Ni (II)毒性的抵抗力方面起著重要作用，為開發對Ni (II)毒性更耐受的生物修復菌株提供了基礎。
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