基于單細胞算法scCODE構建精準腎透明細胞癌免疫治療預測模型
2022年8月25日，復旦大學鄒欣/郝潔團隊和上海交通大學胡曉勇團隊在Frontiers in immunology (IF=8.8) 在線發表了題為：“An immunotherapy response prediction model derived from proliferative CD4+ T cells and antigen-presenting monocytes in ccRCC”的研究論文。該研究使用團隊前期研發的scCODE單細胞數據分析新算法（Briefings in Bioinformatics, 2022），通過整合挖掘腎透明細胞癌單細胞和bulk RNA-seq數據，構建了基于bulk RNA-seq數據的免疫檢查點抑制劑治療療效預測模型，AUC達到93%。
1 研究背景
透明細胞腎細胞癌(ccRCC)是最常見的腎癌組織學亞型，占所有腎細胞癌(RCC)的70%以上。大量腫瘤轉錄組分析顯示，ccRCC被免疫細胞高度浸潤，尤其是T細胞浸潤，其浸潤程度在癌癥基因組圖譜(TCGA)的腫瘤類型中是最高的�；谶@一特點，免疫檢查點阻斷(ICB)療法顯著改善了晚期ccRCC患者中應答者的治療效果。然而，很大一部分ccRCC患者對這種療法沒有反應。這種對ICB反應的差異性突出了識別預測性生物標志物的必要性。之前對腫瘤的全外顯子組測序(WES)和轉錄組測序確定了與ICB結果相關的一些因素，但與其他對免疫療法具有良好反應性的腫瘤相比，ccRCC有其獨特之處，例如，CD8+ T細胞浸潤、腫瘤突變負荷、移碼插入和缺失以及HLA雜合性在其他腫瘤類型中具有促應答效應，然而它們均未被證明與ccRCC的ICB響應相關。迄今為止，推動ICB耐藥性的因素仍然未知。臨床實踐中預測腎細胞癌ICB反應的有效生物標志物依舊缺乏。
2 文章摘要
為了探索在ccRCC背景下對ICB結局具有良好預測性能的免疫細胞亞型及其特征，該研究重新分析了兩個接受ICB治療的ccRCC單細胞RNA測序(scRNA-seq)數據集。作者鑒定出了增殖型CD4+ T細胞亞型、增殖型調節性T細胞亞型以及抗原呈遞單核細胞亞型，它們與ICB結局相關并具有良好的預測性能。這些發現在數個獨立的ICB治療前ccRCC bulk RNA-seq數據集中得到證實。通過整合這三種免疫細胞亞型的marker基因，作者開發了一個預測模型，該模型在CheckMate隊列(172個樣本)中的AUC高達93%。該ICB反應預測模型有望作為一種有價值的臨床決策工具，用于指導ccRCC患者的ICB治療。
3 研究思路
本文的整體研究思路如圖1所示。首先，作者使用scCODE對各細胞類型進行差異表達分析并使用MSigDB進行GSEA分析，從scRNA-seq中鑒定了3種與ICB結局相關的細胞類型（CD4T, Treg, Monocyte）。隨后，作者對上述3種細胞類型進行亞型分析并對差異表達基因表達定位，鑒定出3種細胞亞型（MKI67+ CD4T, MKI67+ Treg, Antigen-presenting monocyte），GSEA和IPA分析顯示這3種細胞亞型與ICB結局密切關聯。然后，作者運用多種方法在多個bulk RNA-seq數據集和獨立scRNA-seq數據集中重復一致地驗證了這3種細胞亞型與ICB結局的關聯。接下來，作者使用這3種細胞亞型的marker基因，通過機器學習算法，篩選出由47個基因組成的ICB響應預測模型——ccRCC.Sig；最后，作者使用6個bulk RNA-seq數據集和4種不同的機器學習算法對ccRCC.Sig的預測性能進行了驗證，并將ccRCC.Sig與9個臨床或分子特征和13個之前發表的ICB響應簽名進行了對比分析。
4 研究結果
1、CD4+ T、Treg 和單核細胞與 ccRCC 患者的ICB 結局相關聯
作者重新分析了兩個scRNA-seq數據集。首先，作者從Bi’s dataset和Au’s dataset中共提取出13種細胞類型；然后使用scCODE依次識別這13種細胞類型中應答者（R）和非應答者（NR）的差異表達（DE）基因，共獲得了26個差異表達基因列表（DE lists）；隨后每一個DE list均分別在MSigDB網站上計算與GOBP, Hallmark, KEGG, Reactome交疊的基因集，共獲得1008個基因集；最后分別用這1008個基因集預測CheckMate cohort（R=39, NR=133）的ICB結局，ROC曲線p值可反應這些基因集對ICB結局預測的有效性。通過對這1008個基因集的p值分析，按照預先設定的篩選標準，作者發現Au’s dataset中非應答者的CD4T（Au’s_CD4T.NR）和Treg（Au’s_Treg.NR）以及Bi’s dataset中應答者的monocyte（Bi’s_Mono.R）的DE list所交疊的GOBP基因集對ICB結局具有顯著的預測性能。作者推測CD4T、Treg和單核細胞的某些亞型可能與ICB響應相關。
2、MKI67+ CD4T和MKI67+ Tregs在非應答者中豐富
作者進一步對CD4T和Treg細胞進行亞型分析，共獲得5個CD4T亞型和4個Treg亞型（圖2A, 2D）。通過GSVA分別對Au’s_CD4T.NR和Au’s_Treg.NR中具有有效預測性能的基因集（p.adjust<0.05）進行表達定位，作者發現CD4T的subcluster 4（CD4T_C4）和Treg的subcluster 3（Treg_C3）均存在最高表達（圖2C, 2F）。因此這兩種細胞亞型很可能與ICB抵抗相關聯。進一步對這兩種細胞亞型的差異表達分析和GSEA分析顯示，這兩種細胞亞型均高表達增殖標記基因（圖2G）并顯著富集細胞周期相關信號通路（圖2H）。因此作者將這兩種細胞亞型分別命名為增殖型MKI67+ CD4Ts和增殖型MKI67+ Tregs。除此之外，作者還發現這兩種細胞亞型均顯著富集促癌/促ICB抵抗相關通路，相反，抗癌/促ICB應答相關通路則顯著被抑制（圖2H），作者利用 IPA分析進一步驗證了上述GSEA分析的結果。
3、在獨立數據集中驗證MKI67+CD4T和MKI67+Treg
GSEA和GSVA顯示，MKI67+CD4T.Sig在CD4T_C4和CheckMate Cohort的非應答者中均顯著富集和高表達（圖3B, 3C）。生存分析顯示，治療前較低的GSVA評分與CheckMate Cohort（n=181）的OS（圖3D, p=0.022）和PFS（圖3E, p=0.022）以及Javelin101 Cohort（n=726，OS數據不可用）的PFS（p<0.0001）改善顯著相關；同樣，治療后較低的GSVA評分也與CM009_POST Cohort（n=55）的OS（p=0.018）和PFS（p=0.0093）改善顯著相關。最后作者通過單因素邏輯回歸發現MKI67+CD4T.Sig能夠有效預測CheckMate Cohort 中患者的ICB結局（p=0.008）。隨后作者用同樣的方法對MKI67+ Treg進行驗證，結果相似。
由于MKI67+ CD4Ts 和 MKI67+ Tregs均來自Au’s dataset，因此作者使用獨立的scRNA-seq數據集Bi’s dataset進一步驗證了MKI67+ CD4Ts和MKI67+ Tregs特征的普遍性。結果顯示MKI67+ CD4Ts和MKI67+ Tregs特征在非應答者中的表達水平顯著更高。
4、抗原呈遞單核細胞與促ICB應答有關
同樣，作者對monocyte進行亞型分析，共獲得4個monocyte亞型（圖4A）。GSVA顯示Bi’s_Mono.R中具有有效預測性能的5個基因集（圖S2e, p.adjust<0.05）在subcluster 0（Mono_C0）中存在最高表達（圖4C）。因此Mono_C0很可能與ICB應答相關聯。對monocyte各亞型進行基因差異表達分析和GSEA分析顯示，與monocyte的其他亞型相比，Mono_C0顯著高表達MHC II類抗原和IFNγ反應相關基因（圖4B, 4E）并顯著富集抗原處理和呈遞相關信號通路（圖4D）。因此作者將Mono_C0命名為抗原呈遞單核細胞。GSEA和IPA通路分析揭示了多種通路變化，這些變化可能與該細胞亞型促進ICB應答相關（圖4D）。隨后作者同樣開發了可用于特異性表征抗原呈遞單核細胞亞型的signature（Mono_C0.Sig），該細胞特征在應答者中顯著富集并高表達（圖4G, 4H）。生存分析顯示，其治療前較高水平的GSVA評分與PFS改善顯著相關（圖4I， p=0.042），但與OS無顯著相關性。同樣，治療后較高水平的GSVA評分與CM009_POST Cohort中患者PFS改善顯著相關（p=0.004）。此外，作者發現在Bi’s dataset中，與未接受ICB治療的腫瘤相比，ICB治療后腫瘤中抗原呈遞單核細胞特征顯著更高，這一發現在治療前后的配對樣本（CM009_Paired Cohort）中被進一步證實。這些結果均可說明ICB治療驅動抗原呈遞單核細胞特征系統性升高，應答者與非應答者相比，該細胞特征進一步升高；并且ICB治療前后該細胞的富集可預示患者ICB治療獲益及其顯著延長的PFS。
5、ICB響應預測模型構建與驗證
作者開發了由47個基因組成的ICB響應預測模型——ccRCC.Sig，該預測模型同時富含MKI67+ CD4T, MKI67+ Treg和抗原呈遞單核細胞特征基因。對于CheckMate Cohort（R=39, NR=133）來說，ccRCC.Sig的預測AUC高達0.93。
接下來，作者通過多種方法和多個獨立bulk RNA-seq數據集對ccRCC.Sig的預測性能進行驗證。首先，作者使用ccRCC.Sig分別預測5個bulk RNA-seq數據集的ICB結局，AUC為0.87-1。其次，在6個bulk RNA-seq 數據集中，作者將 ccRCC.Sig 的預測性能與 13 個已發表的ICB響應簽名（圖5E）和9個臨床和分子特征（圖5F）進行了比較，這些結果表明ccRCC.Sig具備最佳的預測性能。隨后，作者使用4種機器學習算法對ccRCC.Sig的預測性能進行驗證，大多數都達到了極高的AUC(>0.9，圖5G)，這說明ccRCC.Sig具有良好的穩定性。然后，作者對ccRCC.Sig進行了單因素和多因素Cox回歸分析，結果表明，ccRCC.Sig與預后不良顯著相關（圖5H），并可作為ICB治療的獨立危險因素。最后，作者發現ccRCC.sig與已知的ICB響應分子特征顯著相關，如與免疫檢查點分子(PD-1、CTLA4、IDO1)、促ICB抵抗的髓系浸潤特征呈正相關，與促ICB應答的血管生成信號呈負相關。
該研究不僅為ccRCC免疫治療提供了一個有效的預測模型，也為各種預測模型的開發提供了一個可選流程，該方法可適用于各種腫瘤治療的預測模型的開發。
論文的通訊作者為復旦大學附屬中山醫院郝潔研究員，復旦大學附屬金山醫院鄒欣副研究員和上海交通大學附屬第六人民醫院胡曉勇主任醫師。上海交通大學附屬第六人民醫院2021級碩士鄭坤為論文第一作者。
該研究得到了國家自然科學基金（82170045，31800253），上海交通大學醫學院高水平地方高校創新團隊 (SSMU-ZLCX20180502)的支持。
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