重要結果
 

1. 在BC液體活檢中sEV作為生物標志物來源的優勢

目前，用于腫瘤診斷和預后最常見方式是組織活檢。然而，組織活檢很難獲得樣本，并且來自活檢樣本的腫瘤分子和遺傳信息多為早期檢測，篩查和監測存在局限性。為了克服傳統生物標志物鑒定和驗證手段的技術挑戰，提出了基于體液活檢的分析，其重點是利用循環腫瘤細胞（CTCs），循環腫瘤DNA（ctDNA），各類體液（包括血液，尿液和唾液）中的細胞外囊泡（EVs）作為腫瘤診斷和預后生物標志物的來源。與組織活檢相比，體液活檢能夠追蹤異質性，實時監測腫瘤轉移和進展，減少疼痛和副作用，并且獲得樣本的過程更快，更容易。

而在BC體液活檢領域中，許多研究人員已將重點轉向sEV，因為它們在生物體液中相對更豐富，細胞中的生物含量豐富，且形態穩定。對于臨床應用，第一個基于sEV的商業試驗ExoDx™ 前列腺（IntelliScore）于2017年推出，由FDA批準，該測試能夠將前列腺癌癥患者的組織活檢采集量減少27%。這表明，來自體液活檢的sEV為生物標志物的開發開辟了一條新的途徑，可以影響包括BC在內的各種癌癥的診斷、預測和治療。
 

圖1 液體活檢在乳腺癌診斷中的應用

2. sEV分離和表征

理想的sEV富集方法簡單、高通量、快速、成本低、純度高。然而，由于生物樣本的復雜性和EV的異質性，目前的分離方法都不符合這些標準。克服這些障礙的一種可能是結合兩種或多種分離技術。例如，據報道，與單獨使用體積排除色譜法(SEC)或超速離心(UC)相比，在BC細胞系中使用聚乙二醇（PEG）沉淀結合SEC，可在更短的時間內富集20至200倍高濃度的sEV蛋白。此外，在BC患者的血清中進行半個周期的UC后結合ExoQuick或Total Exosome Isolation試劑盒，可顯著提高產量，減少耗時。總之，繼續開發聯合分離技術可能是選擇和分離sEV的可行選擇，這有助于下游分析和臨床應用。

從乳腺癌癥（BC）血樣和細胞系中分離出的sEV可以通過大小、形態、濃度和sEV標記物來表征。sEV尺寸和濃度可以通過納米粒子跟蹤分析（NTA）和單粒子干涉反射成像傳感器（SP-IRIS）進行分析。電子顯微鏡（EM）可以根據大小和形態對sEV進行分類。納米流式細胞術（nFCM）、高靈敏度流式細胞儀（HSFCM）、高分辨率流式細胞（hFCM）和熒光活化囊泡分選（FAVS）可以使用各種sEV標記物對sEV進行亞群分類。sEV蛋白可以通過基于質譜的分析（包括無標記和基于標記的定量）來分析。為了驗證sEV蛋白和肽段標記物，可以使用多重反應監測（MRM）、平行反應監測（PRM）、蛋白質印跡（WB）和酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。
 

圖2 小細胞外囊泡（sEV）檢測和表征

3. 在BC診斷、預后和化療耐藥中sEV蛋白生物標志物的作用

從BC患者的細胞上清液和血液樣本中收集sEV。分離的sEV通過蛋白質組學方法（如液相色譜-串聯質譜（LC–MS/MS）和反相蛋白質微陣列（RPPA））進行分析，并通過sEV蛋白質檢測方法（包括酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和蛋白質印跡（WB））進行驗證。鑒定了BC sEV樣品中的各種上調或下調蛋白，可用于BC診斷、預后和預測BC化療耐藥性。

圖3 sEV蛋白生物標志物

4. 在BC診斷、預后和化療耐藥中sEV miRNA生物標志物的作用

miRNA是長度約為19-25個核苷酸的短單鏈非編碼RNA分子，可以通過直接與靶mRNA的3'非翻譯區結合來抑制基因功能。使用高通量測序（NGS）分析研究發現，miRNA是sEV中最顯著的RNA種類，并鑒定出593種獨特的miRNA。在血液中，將miRNA封裝在sEV中可以提供穩定的環境，促進細胞間的遠距離通信。因此，攜帶釋放到血液中的miRNA的腫瘤衍生sEV可能是疾病診斷、預后和治療管理的寶貴生物標志物資源。

收集BC血漿和細胞上清液樣本，通過逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）、高通量測序（NGS）和微陣列分析分析分離的含有miRNA的sEV。BC樣本獨特的sEV miRNA表達譜對BC的診斷、預后和預測化療耐藥具有價值。
 

圖4 sEV miRNA生物標志物

結論

為了提高BC的診斷和預后，研究人員越來越關注體液活檢，因為其侵襲性有限，適合于腫瘤監測。根據文章描述的證據，監測sEV衍生蛋白和miRNA的變化對于BC生物標志物翻譯具有巨大的潛力和前景。