多組學分析揭示疤痕和再生傷口愈合過程中不同的分子事件（二）
多組學分析揭示疤痕和再生傷口——愈合過程中不同的分子事件（二）
文章題目：Multi-omic analysis reveals divergent molecular events in scarring and regenerative wound healing
中文題目：多組學分析揭示了疤痕和再生傷口愈合過程中不同的分子事件
見刊時間：2022.02
期刊名稱：Cell Stem Cell
影響因子：25.269
實驗平臺：scRNA-seq (10X Genomics)、蛋白質組學（TIMSTOF）
DOI：10.1016/j.stem.2021.12.011
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研究內容（接上文）
之前研究者做了多模式分析，但接下來他們是如何確定了Trps1在再生中的功能意義呢，請見如下研究內容：
4、傷口中纖維化和再生軌跡標志物的分析
研究者之前的分析表明，空間定位——而不僅僅是細胞數量——可能決定了PBS和維替泊芬傷口中不同的表型，因此他們對Trps1 (Wnt通路調節因子)、YAP(機械轉導信號)和Dpp4 (En-1系瘢痕成纖維細胞；圖2M)進行了IF分析。結果顯示，在PBS與替泊芬傷口中，Dpp4+細胞(EPFs)顯著增加，特別是在真皮深處(圖2M右)。與維替泊芬抑制機械轉導一致，YAP在PBS傷口中的表達高于維替泊芬傷口或UW皮膚(圖2M)。Trps1在對照組傷口中表達極低，但在維替泊芬傷口中大量表達，基于人工智能的成千上萬個細胞中Trps1核定位定量顯示，維替泊芬傷口中有較高的核Trps1+成纖維細胞(圖2N)。盡管如之前所述，UW皮膚Trps1表達僅限于基底上皮和真皮乳頭 (圖2M，左)，但在維替泊芬創傷中，在再生HF周圍發現了高核Trps1+細胞簇(圖2M，下)。
PBS和維替泊芬治療的一個顯著區別是后者在30天內出現再生HF；控制傷口形成裸露區域。研究者想知道他們的成纖維細胞軌跡分析是否可以揭示HF/腺體再生的主要調節因子。Trps1是一種鋅指轉錄因子，在再生臂中強烈富集(圖2F和3C)，是首選的候選因子。Trps1曾被報道為一種新的Wnt信號“主調控因子”，并且多項研究表明Trps1參與HF形態發生，Trps1活性異常與人類毛發過度生長(多毛癥)有關，使其成為一種有前途的驅動創面HF再生的候選者。研究者結論表明，Trps1+細胞在再生傷口中富集，并在新生HF周圍空間聚集(圖2M和2N)。據報道，Trps1通過競爭共享的YAP/TEA結構域(TEAD)基因組結合位點在轉錄上調節YAP信號。鑒于再生軌跡以機械轉導降低和Trps1升高為特征，他們推測Trps1可能是創面再生的關鍵調節因子。
基于綜合多模態分析，研究者試圖驗證不同傷口表型中關鍵基因的相關性。他們選擇了四種標記基因來區分不同途徑(例如，機械激活和Wnt信號)和纖維化或者再生臂：Ankrd1 (YAP靶基因)，Trps1 (Wnt調節因子)，Rspo1 (Wnt激動劑)和Dpp4 (EPF譜系標記；圖2C, 2F, 3B和3C)。分析結果顯示，這些基因共同分化了機械激活/促纖維化(Dpp4和Ankrd1)和再生(Rspo1和Trps1)通路。為了探測關鍵基因的空間分布，他們對Ankrd1、Dpp4、Trps1和Rspo1進行了多重RNAscope原位雜交。在POD 14維替泊芬傷口中，在真皮表面發現含有Rspo1和Trps1 RNA顆粒的成纖維細胞聚集在內陷上皮周圍，與新生HF一致(圖5A和圖5C下)。相比之下，POD 14 PBS創面中的Rspo1+和Trps1+細胞在真皮中隨機分散(圖5A和圖5C上)。POD 30是纖維化/再生創面表型差異最大的時間，PBS創面成纖維細胞有更多的Dpp4和Ankrd1，而維替泊芬創面有更多的Rspo1和Trps1 RNA顆粒，集中在再生HF周圍(圖5B和5D)。從數千個細胞中量化顆粒證實了這些趨勢(圖5E和5F)，支持了在YAP抑制的(低Ankrd1)傷口中ENF介導的愈合(低Dpp4)通過Wnt激活(高Trps1和Rspo1)產生HF再生的發現。
6、確定Trps1在再生中的功能意義
考慮到Trps1在Wnt信號、HF形態發生和YAP調節中的重要性，以及Trps1+成纖維細胞與HF再生的空間關系，他們試圖確定Trps1在創面再生中的功能。他們首先進行了成纖維細胞特異性Trps1 OE，以評估Trps1是否足以在正常瘢痕條件下的傷口再生。我們開發了慢病毒載體，編碼帶有蛋白水解T2A連接子的floxed mTrps1:EGFP轉基因基因(成功轉導的成纖維細胞是增強的綠色熒光蛋白[EGFP]+)，當將其皮下注射到它莫西芬誘導的Col1a1-CreERT;Ai9小鼠(成纖維細胞表達報告基因)時，使成纖維細胞特異性Trps1 OE。為了針對不同的修復階段，它們在早期(POD−3和7)都過表達Trps1，以研究其在早期過程中的作用，如炎癥、肉芽形成和早期ECM合成，以及晚期(POD 7和17)，在疤痕(PBS)傷口中，對后期過程如成纖維細胞遷移、ECM沉積和早期重塑。對照組創面(Trps1-OEC)注射FLEXon EGFP慢病毒。結果表明，Trps1-OEC創面形成疤痕，而Trps1-OEE和Trps1-OEL創面疤痕不太明顯，且能再生HF(圖6A)。組織學證實Trps1表達增加(圖6C)，并在Trps1- OEE和Trps1- OEL傷口中顯示少量再生附件結構和更多UW樣ECM(圖6B, 6D，右和6E)；這些發現在定量上得到了證實，明顯更多的HF/腺體和明顯更高的(即更多的UW樣)ECM評分(圖6D)。與Trps1- OEE相比，Trps1- OEL傷口的再生作用更明顯，這表明Trps1的促再生作用可能在早期愈合時間點最大。總的來說，這些發現表明Trps1 OE在一定程度上足以促進傷口再生。
接下來，為了評估Trps1對維替泊芬誘導的傷口再生是否必要，他們開發了miR30-mTrps1慢病毒載體，當對小鼠皮下注射該載體時，使成纖維細胞特異性Trps1 KD(成纖維細胞表達報告基因，轉導細胞表達EGFP)。他們在早期時間點(POD−3/7;Trps1-KDE)和晚期時間點(POD 7/17;Trps1-KDL) 敲除了Trps1。結果顯示，Trps1-KDC傷口顯示毛發再生且無瘢痕，而Trps1-KDE和Trps1-KDL傷口形成無毛瘢痕(圖6F；IF證實Trps1表達下降，圖6H)。
組織學上，Trps1-KDE和Trps1-KDL傷口ECM再生完全消失，取而代之的是瘢痕ECM(圖6G, 6I右，6J)。有趣的是，僅在Trps1- KDL傷口中觀察到附件結構的顯著丟失(圖6G右和6I)，這意味著在愈合后的維替泊芬誘導的附件再生(如HF)中特別需要Trps1。總的來說，這些數據表明Trps1是傷口完全再生所必需的，在早期和晚期愈合中具有不同的作用。
綜上所述，研究者綜合多模式分析區分了兩種修復軌跡。第一種是EPF介導的(Dpp4+)，其特征是機械激活(高核YAP, Ankrd1+，Trps1−)，并導致疤痕ECM。第二種是ENF介導的(Dpp4−)，缺乏機械激活(低核YAP, Ankrd1−，Trps1+)，通過Wnt激活導致正常ECM和HF的再生。
03
主要結論
此研究為利用細胞表面條形碼和多組學分析提供了一個框架，極大地提高了組織動力學的分析，并提出了一種在ENF介導修復中驅動再生的潛在機制。與YAP競爭共享靶位點的Trps1與纖維化較少的轉錄軌跡相關，并在空間上與HF再生相關。他們的研究結果表明，Trps1和下游的Wnt信號也發生在疤痕傷口成纖維細胞中，但在沒有YAP抑制的情況下，表型上由YAP信號主導。這可能表明再生是一種“默認的”修復途徑，被機械激活的纖維化趨勢所取代。
參考文獻
Mascharak S, Talbott HE, Januszyk M, Griffin M, Chen K, Davitt MF, Demeter J, Henn D, Bonham CA, Foster DS, Mooney N, Cheng R, Jackson PK, Wan DC, Gurtner GC, Longaker MT. Multi-omic analysis reveals divergent molecular events in scarring and regenerative wound healing. Cell Stem Cell. 2022 Feb 3;29(2):315-327.e6. doi: 10.1016/j.stem.2021.12.011. Epub 2022 Jan 24. PMID: 35077667; PMCID: PMC8988390.
